力是生物分子相互作用过程中不容忽视的信号,它能直观地反映两个分子间的相互作用强度。从细胞运动到DNA复制和分离,从多肽的折叠到抗原抗体间的结合,几乎所有的生物过程都是由分子级的力来驱动。然而从单分子水平上来了解物质间的相互作用力以及生命过程具有避免集群研究的平均效应、捕获瞬态中间产物和表征非均相体系中的各亚群等优势。目前比较常见的单分子操纵技术主要包括磁镊、光镊以及基于原子力显微镜的单分子力谱技术(AFM-SMFS)。和光镊以及磁镊相比,AFM-SMFS技术其兼具高分辨成像和力学测定两种优势,使它成为研究分子间或分子内相互作用的最有效的手段。但是常规AFM-SMFS需要分别准备每个样品和悬臂,实验工作量增多,导致校准不确定性,并增加了未确定的环境变量的数量。这使得单分子力谱的后续数据筛选及数据分析工作量大且繁琐。然而通过改进,可以将这两种配体分别修饰在AFM探针和具有可寻址功能的DNA折纸上,具有位置优势其关键在于利用DNA折纸的可寻址定位功能更有目的性地探测两分子间的相互作用,使得到的数据更可靠而且易于分析。本论文的主要工作就在于把两条互补的DNA单链分别修饰在AFM探针和DNA折纸上,建立起以具有定位功能的DNA折纸为基底的力谱测定方法,随后综合利用DNA折纸的纳米精度的定位功能以及基于AFM单分子力谱的力学测定功能实现了在一次实验中对连续性碱基错配的高通量检测并可视化定量测定了链霉亲和素与生物素的单分子相互作用力。本论文的具体研究内容如下:第一部分:DNA折纸上单分子结构表征及其空间差异性对分子反应的影响。以DNA折纸作为目标分子地高辛(Digoxin)的纳米级定位模板,对分子个数和分子间距进行精确控制,从而能够从价态以及空间位置上检测Digoxin和IgG分子间的相互作用。第二部分:受到DNA折纸支持生物分子相互作用和结构的精确测量的启发,发展了一种基于DNA折纸的单分子力谱测定方法。以DNA折纸为基底,根据该DNA折纸的几何结构在该DNA折纸上分别选取若干修饰位点,在所选修饰位点的寡核苷酸链的5’端延伸一段目标DNA短链,所述目标DNA短链可与固定于AFM探针上的DNA短链互补配对;然后采用原子力显微镜单分子力谱的方法对位于DNA折纸和AFM探针上的两条互补DNA短链间的相互作用力进行测定,并收集特异性力-距曲线数据。该方法提供了一种检测效率高,特异性和精准度均得到提高的精准高通量单分子力谱方法,这种简便,高效的高通量单分子力谱方法为单分子力学的定量测量提供了一种高效而精确的测量手段。第三部分:利用创建的基于DNA折纸的平行单分子力谱测定方法(Parallel Single-molecule Force AFM Spectroscopy,P-SMFS)实现了对碱基错配的检测。使用程序化DNA折纸,用P-SMFS,我们在几十分钟内就可以成功地区分出折纸上的六种不同的没有或多个碱基错配的靶DNA。特别是,仅仅存在单个碱基对错配的不同目标通过仅4 pN的解除绑定力的差异清楚地区分,这是超出常规AFM-SMFS方法限制的灵敏度。总的来说,我们的方法表明,携带特定靶分子的程序化DNA折纸可以为AFM-SMFS的多重测量提供简单可靠的平台,用于高通量筛选各个生物分子纳米力学性质。第四部分:可视化定量测定链霉亲和素与生物素的单分子相互作用力。由于链霉亲和素和生物素间具有极高的亲和力和比较长的键寿命。在力谱测定体系中通常作为连接物,所以明确各种因素对于链霉亲和素和生物素之间相互作用强度的影响是非常必要的。为了能够对链霉亲和素与生物素进行可视化定量测量。我们利用具有可寻址功能的DNA折纸作为衬底来固定生链霉亲和素分子,把生物素分子固定于AFM探针上,把用生物素功能化的AFM探针垂直接近折纸上的链霉亲和素并做单分子力谱,能够定量获得链霉亲和素与生物素相互作用强度,而且此过程是可视化的,这一方法能可对未来用到链霉亲和素与生物素系统做连接物的单分子力谱提供深入的了解。