死亡时间(postmortem interval,PMI)是指发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔。PMI的准确推断具有重要的法医学实践价值,一直是法医学病理学研究的重点和难点。利用传统的方法进行死亡时间的推断一直受到各种因素的制约,如环境温度,死亡原因等,导致推断的准确性和精确性较低。随着分子生物学技术在法医学领域的广泛应用,利用生物体内RNA的时间依赖性降解规律推断死亡时间正逐渐成为目前研究的热点。实时定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)作为RNA表达量的精确定量技术,具有准确高效的优点,被越来越多的应用于PMI的推断,但其结果必须依赖于稳定内参指标的标准化,目前构建的推断PMI模型相对单一,通常只考虑单个因素的影响,而忽略多组织、多温度和多死因的探讨,实际应用受限。本实验利用实时定量PCR技术,检测已知明确死亡时间的人体组织和动物模型组织中(心肌、肝脏和皮肤)多个RNA指标的表达量,以期发现受各因素影响较小的RNA指标作为标准化的内参指标。在此基础上,针对大鼠组织内特定RNA指标进行死后不同时间的规律性研究,综合多个分子指标构建多组织、多温度组的数学模型用以推断死亡时间；将明确死亡时间的大鼠样本和人体资料代入方程进行验证,探讨环境温度及死亡原因等因素对死亡时间推断的影响程度,以期为人体死亡时间的精确推断提供新的方法与理论基础。此外,本研究也通过构建不同死因的大鼠模型,检测心肌多种RNA指标在死后不同时间点的表达变化情况,以期为不同死因下的死亡时间推断提供一种新的思路。研究目的1.通过实时定量PCR技术对人体组织及大鼠组织中各RNA指标的转录水平进行检测,旨在寻找出稳定通用的内参标志物用以精确的推断死亡时间。2.设置四个连续的温度组,明确断颈死大鼠三种组织中各RNA死后降解规律与死亡时间的相互关系,利用标准化的qRT-PCR数据构建多参数数学模型推测死亡时间。利用已知死亡时间的大鼠样本和人体样本进行数学模型的验证,统计推断死亡时间和真实死亡时间之间的误差率,明确环境温度及死亡原因等因素对死亡时间推断的影响。3.构建断颈死、窒息死和失血性休克三种大鼠死亡模型,明确不同死亡原因下大鼠心肌内多种RNA表达量随随死亡时间的降解规律,以期为不同死因下死亡时间的推断提供参考。方法和结果第一部分1.委托上海市公安局刑事科学技术研究所收集79例人体案例样本组织,每例尸体都准确的记录死亡时间、温度、死因等。每例尸体均取心肌、肝脏和皮肤组织分装于RNAlater保护液,置于-80℃冻存、备用。2.断颈处死288只SD大鼠用以构建模型,尸体立即放置于恒定环境温度下(5±1℃、15±1℃、25±1℃和35±1℃),于死后12个时间点(Oh、1h、3h、6h、12h、 24h、36h、48、72h、96h、120h和144h)分别取出心肌组织、肝脏和皮肤组织；断颈处死6只SD大鼠用以验证模型,放置于恒定环境温度下(10±1℃和20±1℃),于后3个时间点(15h、45h and 95h)取出三种组织；所有组织分装于RNAlater保护液,置于-80℃冻存、备用。选取12个常用的RNA分子指标,并设计引物,分别是ACTB、GAPDH、18S、RPS29、5S、U6、let-7a、miR-1、miR-133a、miR-206、miR-122和miR-203。3.用TRIzol法抽提人体和大鼠组织的总RNA、总RNA浓度和纯度检测和cDNA合成,并应用qRT-PCR检测RNA指标的循环阈值(cycle threshold,Ct)。4.通过geNorm软件对12个候选分子标志物进行统计处理,选取人体组织与动物组织相统一的内参指标。结果显示：5S、U6、miR-133a和RPS29适合作为心肌组织的内参,5S、U6、RPS29和miR-122适合作为肝脏组织的内参,5S、U6、RPS29和miR-203适合作为皮肤组织的内参。第二部分5.对ACTB和GAPDH的Ct值进行内参标准化处理,建立循环阈值差值(deltaCt,△Ct)与PMI的回归方程(一次、二次和三次方程),择优选择构建数学模型。6.将已知PMI的大鼠样本和人体样本△Ct值带入方程进行验证,统计推测PMI的误差率,明确环境温度、死亡原因等因素对精确PMI推断的影响。验证结果表明大鼠样本的总误差率为14.4±2.2%,人体样本的总误差率为34±19%,证实运用该数学模型推断PMI相对准确有效。7.研究发现环境温度升高可以明显的增加RNA的降解速率,详细的环境温度记录可以有效的提高推断PMI的精度。8.在三种组织中,肝脏组织拥有最低的误差率,尤其适合早期PMI的推断；而心肌组织更适合用于晚期PMI的推断；虽然皮肤组织具有最高的误差率,但在某些特殊案件如碎尸案有无可取代的价值。9.死亡原因也对RNA表达量具有影响,GAPDH表达量在失血性休克样本和机械性窒息样本中表达上调,导致推断的PMI小于真实PMI,误差率为负值。第三部分10.135只SD大鼠随机分为断颈死组、窒息死组和失血性休克死组,尸体保存于室温(25±1℃)环境下,于死后9个时间点(Oh、3h、6h、12h、24h、36h、48h,72h和96h)提取心肌组织,分装于RNA later保护液中,置于-80℃冻存、备用。并应用实时荧光定量PCR检测GAPDH、ACTB、HIF-1、iNOS、TNF-α、IL-6和U6的Ct值,观察各RNA在不同死因下随PMI的变化情况。11.U6非常稳定,受PMI和死因的影响较小,适合作为内参指标。在死亡早期,GAPDH、HIF-1、iNOS、TNF-α和IL-6的表达量在窒息死组和失血性休克死组比断颈死组呈现不同程度的增加,而ACTB在三个组皆呈现表达量下降趋势。在死亡晚期,随着mRNA的不断降解,各RNA指标表达量持续下降。因此,死后各RNA相对表达量随PMI的特征性的变化可为不同死因下PMI的推断提供参考。结论与展望本课题按照标准化的qRT-PCR技术流程,筛选出稳定通用的内参标志物,并通过多温度、多组织的动物模型,综合多个分子指标构建数学模型推断死亡时间。应用大鼠样本和实际案例检验数学模型,较低的误差率证实此方法的精确性和可靠性,同时探讨环境温度及死亡原因等因素对于死亡时间判断的影响程度。本课题将继续收集人体样本(增加样本种类、数量)进行大量的组织验证,进一步优化数学模型,提高人体死亡时间推断的精确性,使之更有利于法医实际工作的开展。