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背景子宫内膜癌是女性生殖道最常见的三大恶性肿瘤之一,其发病率逐年增高,美国癌症协会统计数据表明2014年在美国大约有52630例新增病例以及大约8590例死亡病例[1]。某些研究发现糖尿病、胰岛素抵抗以及肥胖是发展为子宫内膜癌的危险因素[2,3],不幸的是,肥胖不仅是子宫内膜癌的一个危险因素,同时也认为其增加了患者的死亡风险[4]。手术常常用于治疗早期的子宫内膜癌患者,而对于月经不调、多囊卵巢及长期不排卵的年轻患者而言:如何保留其生育功能一直是治疗的难点[5]。孕激素及其合成形式醋酸甲羟孕酮(MPA)在临床上已经广泛应用于治疗希望保留生育功能以及晚期、复发的子宫内膜癌患者,但其治疗有效率一直不太理想,研究表明长期孕激素治疗的反应率仅达16%-34%[6]。一些研究认为孕激素耐药的产生是治疗子宫内膜癌失败的根本原因[7]。改善孕激素耐药,提高孕激素治疗子宫内膜癌的效果是目前临床上面临的一个难题。因此寻找一种药物能够缓解子宫内膜癌的进展或者改善子宫内膜癌的预后是现在临床治疗上亟待解决的问题。研究表明肿瘤细胞能够分泌大量的生长因子,其中表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF)是重要的能够促进上皮增生的生长因子,其能够促进细胞的增殖同时抑制癌细胞的凋亡。表皮生长因子系统(EGFs)是由EGF及其受体EGFR(表皮生长因子受体)组成[8]。表皮生长因子受体(EGFR)家族是跨膜受体酪氨酸激酶的一种,共包括四个成员,分别是Erb B-1,也被称为EGFR,因为EGFR是原癌基因c-erb B1的表达产物;Erb B-2(也被称为HER2或者neu);Erb B3(也被称为HER3)及Erb B4(也被称为HER4),其通过调控多种与细胞生长相关的基因的表达来调节细胞周期的进展从而影响细胞的增殖、迁移、分化和生存[9]。大量的研究报道表明EGFR在大量的肿瘤细胞中过度表达,包括子宫内膜癌细胞;过度表达的EGFR与疾病不良的预后相关[10]。关于子宫内膜癌孕激素耐药机制的研究中,有报道称孕激素耐药与EGFR过度激活有关,但其具体调节机制不明[11]。近年研究表明,表皮生长因子受体(EGFR)过表达可降低子宫内膜癌细胞对孕激素的敏感性,使其产生耐药,诱导子宫内膜癌细胞发生上皮-间质转化;EGFR表达过高可导致其下游信号分子持续活化,而其通路抑制剂AG1478可有效抑制该通路重要信号分子的激活[12]。流行病学调查研究发现子宫内膜癌患者中约11.1%合并糖尿病,糖尿病与子宫内膜癌的关系已由队列研究和病例对照研究所证实:合并2型糖尿病可使子宫内膜癌的发病风险增加1-3倍[13]。临床工作中胰岛素增敏药二甲双胍广泛应用于治疗2型糖尿病,在妇科领域中为改善胰岛素抵抗症状,被广泛应用于多囊卵巢综合症的治疗。研究发现二甲双胍可提高孕激素治疗早期子宫内膜癌和子宫内膜非典型增生的临床治疗效果[14-17]。本课题的前期研究发现二甲双胍通过激活AMPK信号通路,活化的AMPK抑制AKT/m TOR信号通路,此级联导致了体外培养的子宫内膜癌细胞的增殖受到明显抑制,同时促进孕激素受体的表达;另外,二甲双胍能够减弱IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的促进子宫内膜癌细胞增殖的作用;在裸鼠体内实验也验证了二甲双胍能够显著抑制子宫内膜癌细胞的增生[18、19]。以上提示二甲双胍能够抑制体内外子宫内膜癌细胞的生长,并有可能改善孕激素的耐药,提高孕激素的临床治疗效果。本实验旨在以体外培养的人子宫内膜癌Ishikawa(高分化)、HEC-1A(中分化)及AN3CA(低分化)细胞作为研究对象,观察不同浓度的二甲双胍联合或者不联合EGFR-TK抑制剂对分化程度不同的子宫内膜癌细胞增殖的影响及二甲双胍对EGFR和ERK相关通路蛋白表达的变化。目的通过细胞增殖实验(CCK-8)分析二甲双胍对子宫内膜癌细胞增殖的影响;应用荧光定量PCR、western blot技术分析EGFR信号通路在二甲双胍对子宫内膜癌细胞中的作用,为临床治疗子宫内膜癌提供一个新的思路。方法1.细胞增殖法(CCK-8)检测不同浓度的二甲双胍联合或者不联合EGFR信号通路抑制剂AG1478对分化程度不同的子宫内膜癌细胞增殖的影响;2.应用荧光定量PCR(RT-PCR)法检测不同浓度的二甲双胍对EGFR m RNA的影响;3.应用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测二甲双胍作用下子宫内膜癌细胞磷酸化EGFR/总EGFR和磷酸化ERK/总ERK蛋白水平的变化。4.统计学处理:采用SPSS19.0软件对试验结果数据进行统计学分析;所有实验均独立重复3次,多组间数据采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t法,P<0.05即差异有统计学意义。结果1.二甲双胍和EGFR-TK抑制剂AG1478均能抑制分化程度不同的子宫内膜癌细胞的增殖,同时二甲双胍可增强AG1478对子宫内膜癌细胞的抑制作用(P<0.05);2.二甲双胍能够降低子宫内膜癌细胞中EGFR m RNA的表达,其作用成剂量依赖性(P<0.05);3.二甲双胍作用于子宫内膜癌不同时间后,总的EGFR及总的ERK的蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),而磷酸化的EGFR及磷酸化的ERK蛋白表达水平降低(P<0.05),抑制了EGFR及ERK信号通路,其作用呈时间依赖性(P<0.05)。结论1.二甲双胍可抑制子宫内膜癌细胞的增殖,同时能够增强EGFR信号通路阻断剂AG1478对子宫内膜癌的抑制作用;2.二甲双胍可能通过调节EGFR信号通路即抑制EGFR磷酸化蛋白的表达从而抑制其下游ERK蛋白的磷酸化,即抑制ERK信号通路的激活进而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。