下颌髁突软骨作为颞下颌关节的重要生长区,与颅面骨骼的形态发育和颞下颌关节功能区的形成密切相关。下颌髁突软骨细胞肥大化是髁突发育过程中的关键生理过程,是髁突软骨内骨化的基础,是受一系列基因和信号分子精密调控的有序过程。如果调控编码肥大过程的细胞因子或基因发生突变,将导致细胞增殖和肥大平衡失调,进而引起髁突发育和功能异常。而髁突软骨作为一种无血管无神经的组织,它自我修复和再生的能力十分有限。因此深入基因水平对软骨细胞肥大化进程的探索,有助于我们进一步的了解髁突软骨的生长机制、病理和修复过程,为基础和临床研究提供一定参考,并为髁突软骨损伤的修复提供新思路和方向。miRNAs(micro RNAs)是新近发现的小分子调控RNA,其在基因调控中扮演了重要角色。目前很多研究表明micro RNAs在生长板软骨生长分化以及肥大化过程发挥重要的调控作用。髁突软骨的成骨方式和生长板软骨一样都属于软骨内成骨,但两者在组织结构,生长方式和对环境因素的反应诸多方面又存在着诸多不同,所以对于和生长板软骨千差万别的髁突软骨,相关的mi RNA研究很显然不能够照搬。本文旨在探索在髁突软骨肥大分化过程中发挥关键作用的mi RNAs,并通过靶基因预测等高级分析,揭示其在肥大过程中的调控机制。实验方法:本研究以3月龄的健康成年家猪的新鲜髁突为研究对象,利用冰冻切片机将组织分层后,分为对照组(增殖细胞层)和实验组(肥大细胞层)。提取两组组织的RNA,质检合格后采用Illumina公司的Solexa高通量测序技术对样本进行mi RNA检测。筛选出两组中差异表达的mi RNA,随后进行q RT-PCR验证,并对相应mi RNA进行靶基因预测,GO分析和KEGG分析等功能分析,以揭示在髁突软骨细胞肥大过程中发挥重要作用的mi RNA及相关机制。实验结果:1.两组组织中差异mi RNA的筛选通过比对mi RBase 21.0数据库,在PCL和HCL文库分别识别出303种和313中已知mi RNA,其中在两个文库中均识别到的mi RNA有299种。我们在两组中鉴定出差异表达的mi RNA有41个,其中显著上调15个,显著下调26个。2.差异mi RNA的q RT-PCR验证验证结果显示高通量测序与q RT-PCR验证结果之间有很好的一致性,反应了本研究所获得的高通量测序数据可信度高。3.靶基因的预测及生物信息学分析利用mi Randa数据库对差异显著的41个mi RNAs进行靶基因预测,共预测出靶基因39247个,针对这些靶基因进行后续的GO和KEGG功能分析。GO分析显示这些靶基因主要参与了细胞增殖和代谢、细胞运动及蛋白结合、糖类和脂类等大分子代谢和合成等生物过程。KEGG显示与肥大进程密切相关的信号通路包括Notch信号通路(ssc04330),Wnt信号通路(ssc04310),TGF-β信号通路(ssc04350)等。实验结论:1.实验组与对照组间的mi RNA差异表达谱,包括14个上调mi RNA和27个下调mi RNA,q RT-PCR验证确认了高通量测序结果真实可靠。2.GO分析提示靶基因功能集中于与大分子代谢和合成密切相关的细胞增殖和代谢、细胞运动及蛋白结合、糖类和脂类等,KEGG通路分析则提示Notch信号通路(ssc04330)可能是mi RNAs在软骨肥大调控中的作用途径。3.我们的实验结果与前人的研究结果具有较好的一致性,可以为mi RNA在软骨细胞肥大机制中的作用提供有价值的参考。