阴道重建术是解决先天畸形及后天疾病所致的无阴道患者性生活和性角色的主要方法。目前阴道重建的方法很多但尚无公认一致的方法。理想的方法应该既能形成结构和功能均接近生理状态的阴道以满足患者的性生活的需求,又能尽量减少对自身组织的损伤。目前最常用的重建方法是在膀胱和直肠之间造穴并以各种不同的组织衬里覆盖创面重建阴道,组织衬里的选择在很大程度上决定了手术的效果,常用的组织衬里有腹膜,皮片,皮瓣,口腔黏膜、头皮等自体组织及羊膜,胎儿皮肤等异体组织,自体组织重建阴道给患者带来新的创伤且存在自体取材受限的问题,异体组织又可能感染外源性疾病,均非理想的组织衬里材料,近年来随着组织工程学的发展为阴道重建提供了新思路。近年已有学者应用组织工程支架材料做衬里为患者行阴道重建术,虽然应用这些材料亦能成功的重建阴道,但是单纯应用这些材料术后阴道黏膜上皮化速度较慢,易出血,增加感染和术后阴道挛缩的机会。动物实验研究已经证实种子细胞与支架材料复合后能促进重建阴道各种组织成分的再生,可构建一个更接近生理状态的阴道。目前用于阴道重建的种子细胞主要有阴道上皮细胞,阴道平滑肌细胞和肌源干细胞。虽然应用这些细胞后可以更好的构建组织工程阴道,但是这些细胞培养条件要求较高,不利于大量培养和临床应用。骨髓间充质干细胞来源充足,分离培养方法成熟,易于培养,有多向分化能力,旁分泌功能,免疫原性低,可用于自体和异体组织重建。已有研究证实骨髓间充质干细胞局部应用促进创伤愈合,与小肠黏膜下基质(SIS)复合后促进重建组织的修复。SIS来源广泛,制作方法相对简单,且含有多种生长因子,已被用于多种组织工程组织的构建,是一种比较理想的支架材料,因此本研究尝试用骨髓间充质干细胞作为种子细胞与SIS复合后重建阴道,探讨其在阴道重建中的作用。第一部分骨髓间充质干细胞与SIS的复合及骨髓间充质干细胞的标记目的:探讨骨髓间充质干细胞与SIS的复合方法,优化复合条件,选择适合的标记方法为后续的研究奠定基础。方法:制备SIS并用光学显微镜和扫描电镜观察。用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。(1)消化收集第3代骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度为4×106/ml、2×106/ml、1×106/ml。分别接种于96孔板中预湿后的SIS上(每个浓度12个孔每孔100μl),分别于复合后1,3,5,7天每天取3孔用MTT法检测细胞活性,比较复合浓度及复合时间对复合效果的影响。(2)消化收集第3代骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度为4×106/ml、2×106/ml、1×106/ml,分别接种于96孔板中预湿后SIS上(4×106/ml 12个孔,2×106/ml 21个孔,1×106/ml 9个孔),24 h后首次换液,此后隔日换液一次,复合后第2天2×106/ml,1×106/ml浓度中的9个孔以相同细胞浓度重复接种一次,分别于复合后1,3,5,7天每天取3孔用MTT法检测细胞活性,比较复合次数对复合效果的影响。(3)SIS用不同的预湿方法(新法,旧法)处理后,消化收集第3代骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度为4×106/ml、2×106/ml分别接种于96孔板中两种预湿方法处理后的SIS上(每个浓度,每种预湿方法3个孔),24 h后用MTT法检测细胞活性,比较预处理方法对复合效果的影响。光学显微镜,扫描电镜观察复合情况。CM-Dil标记骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察标记效果。结果:制备的SIS光学显微镜下观察无细胞残留,扫描电镜观察见SIS浆膜面光滑,黏膜面粗糙。用全骨髓贴壁法成功的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。(1)2×106/ml MSCs与SIS复合后第一天粘附率最高(OD值为1.109±0.048)。(2)复合后同一时间,2×106/ml MSCs与SIS复合后的粘附率(OD值为0.548±0.044)不及1×106/ml MSCs与SIS分两次复合后的粘附率(OD值为1.176±0.056),但两次复合后1天的粘附率(OD值为1.176±0.056)并不比高浓度单次复合后1天的粘附率高(OD值为1.488±0.049),随时间延长粘附率下降。(3)2×106/ml MSCs与新法预处理的SIS复合后粘附率高(OD值为2.013±0.049 vs.1.684±0.156)。MSCs与SIS复合后光学显微镜下可见SIS黏膜面有较多细胞附着,浆膜面几乎无细胞附着。扫描电镜可见细胞附着在SIS表面,呈长梭形或不规则形状,细胞表面可见颗粒状物及微绒毛。以终浓度5μM的CM-Di I标记细胞24小时后荧光显微镜观察可见干细胞膜呈橙黄色,胞核不着色,标记率几乎达100%。结论:新的预湿方法,MSCs以2×106/ml的浓度(约5×105个/cm2)与SIS复合1天后粘附率最高。CM-Di I能成功的标记MSCs,为后续实验奠定基础。第二部分骨髓间充质干细胞对大鼠重建阴道的影响目的:通过比较SIS和SIS复合MSCs后重建的大鼠阴道,探讨MSCs对大鼠重建阴道的影响。方法:44只雌性SD大鼠随机分成2组,单纯SIS组(SIS组)和MSCs复合SIS组(SIS+MSCs组)。手术切除大鼠阴道,分别将SIS和与MSCs复合后的SIS移植入切除阴道后形成的腔穴内重建大鼠阴道。每组分别于术后2周,4周,12周随机处死6只大鼠,取阴道全层进行相关检测,冰冻切片荧光显微镜下观察阴道组织中的干细胞,石蜡切片HE染色,免疫组化SP法检测新阴道组织中上皮,平滑肌及神经的表达情况。每组剩余4只于12周处死用于组织浴槽检测,先给予高浓度的K溶液(终浓度124 m M),阴道组织收缩说明组织活性好可以用于后续实验,如果没有收缩则弃用。依次给予不同浓度的去氧肾上腺素(终浓度10-6,10-5,10-4 M),用酚妥拉明(10-4 M)阻断后再次给予去氧肾上腺素(终浓度10-4 M)观察阴道组织张力变化情况。给予不同的电场刺激(electrical field stimulation,EFS),刺激参数:单脉冲方波、波宽1ms,电压30v,频率为30,60,90Hz持续0.5s以及30,60,90Hz持续1s,观察阴道组织的张力变化情况结果:成功构建两组大鼠阴道重建模型。(1)新阴道的大体观察:2周:已不能分辨SIS,新阴道表面较薄,粉红色,质韧,无弹性。4周:新阴道表面增厚,粉白色,质韧,无明显弹性。12周:新阴道表面较光滑,粉白色,质地较4周时软,有一定的弹性。SIS+MSCs组比SIS组新阴道表面更光滑弹性更好,取材时发现SIS+MSCs组分离下来的新阴道比SIS组薄,软,12周时更加明显且弹性更好。(2)干细胞的示踪:术后2周,4周,12周重建阴道组织中均可见橙黄色的MSCs,低倍镜下可见橙黄色的MSCs主要分布在深层组织中,表层少,高倍镜下可见存活的MSCs胞核部位无荧光,DAPI染色后可见蓝色胞核周围包绕橙黄色荧光,细胞结构清晰。(3)重建阴道的组织学观察:两组重建阴道2周时均可见有部分上皮从阴道入口向上爬行,伴有炎细胞浸润,SIS+MSCs组上皮的生长速度较SIS组快。4周时两组上皮均能覆盖整个阴道,SIS+MSCs组的炎细胞浸润较SIS组少。12周时两组上皮进一步成熟,基底层可见钉状突起,无明显炎细胞浸润,与正常阴道无明显区别。(4)新生上皮广谱角蛋白AE1/AE3染色阳性,α-SMA免疫组化染色结果显示新阴道4周时出现少量平滑肌组织,12周可见肌束形成,SIS+MSCs组多于SIS组。PGP9.5免疫组化染色结果显示术后3个月皮下组织中可见少量神经纤维,SIS+MSCs组多于SIS组,但是仍与正常阴道组织有明显差异。(5)在组织浴槽实验中给予10-6,10-5,10-4M去氧肾上腺素后阴道组织呈浓度依赖性的收缩,正常阴道,SIS组和SIS+MSCs组重建阴道的收缩强度分别为高钾溶液诱导的收缩强度的18.471%,81.753%,141.196%;63.354%,148.058%,170.243%和52.572%,165.558%,181.171%。三组阴道组织收缩反应有明显差异(P<0.001),进一步两两比较发现两组重建阴道的收缩强度均明显高于正常阴道,但两组重建阴道之间比较无明显差异。酚妥拉明阻断后收缩强度减小,正常阴道,SIS组和SIS+MSCs组重建阴道的收缩强度分别为未阻断时的39.777%,48.540%,40.466%,三组之间比较无明显差异(P=0.672>0.05)。在30v,持续1s,频率为30,60,90Hz的电场刺激下正常阴道,SIS组和SIS+MSCs组重建阴道组织的收缩强度分别为高钾溶液诱导的收缩强度的113.732%,222.179%,254.331%;11.256%,18.214%,20.251%和28.348%,51.406%,57.535%,三组之间比较有明显差异(P<0.001),进一步两两比较发现,虽然两组重建阴道的收缩强度均明显低于正常阴道,但SIS+MSCs组重建阴道的收缩强度明显高于SIS组结论:复合MSCs后能促进重建阴道上皮,平滑肌和神经的再生。重建阴道对去氧肾上腺素的反应比正常阴道强,酚妥拉明阻断后收缩强度的变化情况与正常阴道无明显差别,提示再生平滑肌组织中肾上腺素能受体表达可能多于正常平滑肌。虽然两组重建阴道的收缩强度均明显低于正常阴道,但SIS+MSCs组重建阴道的收缩强度明显高于SIS组,进一步证明MSCs能促进重建阴道平滑肌的再生。第三部分骨髓间充质干细胞与SIS复合促进大鼠重建阴道修复的机制目的:探讨骨髓间充质干细胞与SIS复合促进大鼠重建阴道修复的机制方法:免疫组化SP法检测两组重建阴道组织中的微血管密度(MVD)。免疫荧光法在检测SIS+MSCs组重建阴道中的微血管的同时,观察局部定植的干细胞与微血管的关系。RT-q PCR,western blot检测重建阴道组织中VEGF m RNA和蛋白的表达。结果:(1)CD34阳性表达定位于血管内皮细胞的胞质或胞膜,用于标记并计数MVD。术后2周SIS+MSCs组重建阴道组织中MVD值为36.347±4.054明显高于SIS组重建阴道组织中的28.278±6.259(P=0.024<0.05)。术后4周SIS+MSCs组重建阴道组织中MVD值明显高于SIS组(31.325±6.064 vs.22.250±4.385,P=0.014<0.05)。术后12周SIS+MSCs组重建阴道组织中MVD值为25.347±4.077明显高于SIS组的20.833±2.246(P=0.039<0.05)。(2)组织中血管内皮表达CD34呈绿色荧光,可见一些CM-Dil标记的橙黄色MSCs位于血管周围,但是MSCs并不表达CD34。(3)VEGF m RNA在SIS+MSCs组重建阴道组织中相对于SIS组的表达量术后2周为1.490±0.436;术后4周为1.562±0.375;术后12周为1.432±0.319,均明显高于同期SIS组的表达量(2周,P=0.040<0.05;4周,P=0.022<0.05;12周,P=0.022<0.05)。(4)术后2周SIS组和SIS+MSCs组重建阴道组织中VEGF蛋白的表达量分别为0.146和0.156,两组比较差异无统计学意义(P=0.817>0.05)。术后4周SIS+MSCs组重建阴道组织中VEGF蛋白的表达量(0.156)明显高于SIS组(0.104)(P=0.039<0.05)。术后12周SIS+MSCs组重建阴道组织中VEGF蛋白的表达量(0.145)明显高于SIS组(0.091)(P=0.023<0.05)。结论:SIS+MSCs组重建阴道的微血管密度高于SIS组重建阴道。未发现组织中定植的干细胞向血管内皮分化。SIS+MSCs组重建阴道组织中VEGF m RNA及蛋白的表达增高。干细胞可能通过促进血管形成,改善局部微环境来促进重建阴道各组织成分的再生。