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引言和目的:前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是一种发病率较高的泌尿生殖系统恶性肿瘤,其发病率与种族、地域等因素密切相关。经雄激素剥夺治疗(Androgen deprive therapy,ADT)后进展为去势抵抗性前列腺癌(Castration resistant prostate cancer,CRPC)的患者,其平均生存期在2年内。恩杂鲁胺是新一代选择性雄激素受体(Androgen Receptor,AR)拮抗剂,较比卡鲁胺等一代药物,对AR具有更高的亲和力。初始对恩杂鲁胺敏感的前列腺癌患者经治一段时间后会出现耐药。但有关恩杂鲁胺耐药性的产生是否与生长因子信号异常激活有关,目前尚未明晰。本研究将通过系列实验揭示恩杂鲁胺对生长因子信号通路的影响,并讨论其相互间作用的具体机制。材料和方法:通过逐步提高恩杂鲁胺加药浓度的方法培养C4-2细胞,3个月后即可获得C4-2R,即恩杂鲁胺耐药细胞株。同时从Allen Gao教授处获赠一组C4-2B/C4-2BR细胞株。为了研究恩杂鲁胺抗性是否部分归因于生长因子信号的异常激活,我们重点关注胰岛素样生长因子-1受体(Insulin-like Growth Factor 1 Receptor,IGF-1R)和表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)通路及其下游效应产物AKT、ERK1/2等。本实验将用恩杂鲁胺预处理C4-2/C4-2B细胞3天,加入EGF刺激后,用蛋白印迹(Western blot)检测AKT和ERK1/2蛋白的磷酸化表达随着刺激时间迁移改变情况。并用慢病毒来建立稳转Beclin-1的PCa细胞系,经表皮生长因子(Epithelial Growth Factor,EGF)刺激后检测AKT、pAKT、ERK1/2和p-ERK1/2的表达情况。同时利用MTT、Brd U和台盼蓝染色实验检测调控Beclin-1表达或应用ERK抑制剂对前列腺癌细胞恩杂鲁胺治疗的影响;利用CO-IP、PI3P ELISA等试验来揭示恩杂鲁胺通过影响AR-Beclin-1复合物活性,调控生长因子信号通路激活的具体作用机制。结果:结果发现,加药组和耐药组中AKT(S473和T308)的基础磷酸化水平较对照组明显增加。不过在EGF刺激时间延长情况下,这种增加趋势不会维持。而磷酸化ERK1/2在受到EGF刺激后,恩杂鲁胺处理组和耐药组信号明显增强,且较对照组持续时间显著延长。机制研究通过在C4-2细胞中沉默Beclin-1表达后发现,与EGF刺激下的对照相比,sh BECN1-C4-2细胞中AKT(T308和S473)和ERK1/2的磷酸化水平显著增加且持续时间更长。然而,过表达Beclin-1仅能逆转恩杂鲁胺治疗增强的ERK1/2生长因子信号而非AKT信号通路。研究还发现,C4-2R和C4-2BR细胞中的Beclin-1蛋白表达均低于C4-2和C4-2B,并且在沉默Beclin-1表达后,PCa细胞恩杂鲁胺治疗敏感性显著降低。而使用ERK抑制剂处理,可部分逆转sh BECN1-C4-2亲代细胞以及C4-2R/C4-2BR细胞的恩杂鲁胺治疗敏感性。实验还在C4-2R和C4-2BR细胞中过表达Beclin-1蛋白,发现恩杂鲁胺治疗敏感性显著增加。除了MTT实验之外,我们还利用了台盼蓝计数板及Brd U染色,进一步证实了敲低或过表达Beclin-1蛋白对恩杂鲁胺治疗的影响。机制研究部分,利用CO-IP实验证实了AR可与Beclin-1蛋白在蛋白层面直接相互作用,且恩杂鲁胺处理可增加AR和Beclin-1之间的相互作用,以及Beclin-1-Vps15-Vps34复合物的形成。与AR的作用效果一致,在经恩杂鲁胺预处理之后,在AR表达阴性的Du145细胞系中未发现Beclin-1-Vps15-Vps34复合物形成增加,这进一步提示恩杂鲁胺治疗对Beclin-1复合体的调控作用可能是通过影响AR来实现的。此外,我们应用ELISA法来测量PI3P的产生,因为细胞总PI3P脂质水平可侧面反应生长因子的激活程度。我们发现恩杂鲁胺处理可显着降低PI3P的产生,这与敲低Beclin-1之后ELISA数据一致,进一步支持恩杂鲁胺可促进AR与Beclin-1复合物的相互作用影响后者的活性,最终激活ERK生长因子信号通路。为了进一步区分AR与Beclin-1的相互作用机制区别于Beclin-1经典自噬机制,我们在C4-2细胞中敲掉了ATG5的表达。结果表明,Beclin-1参与早期内体形成过程,而该功能与其本身自噬功能无关。结论:1.恩杂鲁胺治疗可增强并维持EGF激活的ERK生长因子信号通路;2.Beclin-1可调控EGF激活的、恩杂鲁胺增强并维持的ERK生长因子信号通路;3.调控Beclin-1基因可影响PCa细胞接受恩杂鲁胺治疗的敏感性;4.恩杂鲁胺处理可促进AR-Beclin-1复合体形成,抑制Beclin-1复合体转运失活ERK生长因子信号通路;5.应用ERK信号通路小分子抑制剂可有效抑制恩杂鲁胺耐药CRPC细胞生长,为CRPC患者潜在的治疗靶点。