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[目的] 近年来的研究表明,肿瘤抵抗癌症治疗并不一定是肿瘤内部出了问题,其与微环境的相互作用也发挥了重要作用。而肿瘤微环境中最多也最重要就是肿瘤相关巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞的极化对肿瘤的发展与转归发挥着重要的调节重要,而肿瘤细胞本身也可通过多种途径影响肿瘤相关巨噬细胞的极化,二者相互作用,互相影响,构建了一个有利于肿瘤生长的微环境,如何干预微环境使其朝对肿瘤有害的方向发展是本研究着重要解决的问题。本研究从胶质瘤细胞与微环境细胞间信息交流的载体外泌体出发,探讨了SPHK2如何影响外泌体的分泌以及外泌miRNA的改变,从而影响肿瘤相关巨噬细胞的极化,最终影响胶质瘤细胞自身的增殖能力。以期进一步了解胶质瘤发生、发展的分子机制,为胶质瘤分子病理学诊断和患者预后评估筛选可靠的分子标志物,为恶性胶质瘤基因干预和分子靶向治疗筛选抑瘤因子和干预靶点,并为建立相应的干预策略提供客观的理论依据。 [方法] 1.采用锁核酸探针原位杂交技术(ISH)检测WHOⅡ~Ⅳ级共60例胶质瘤组织和10例非肿瘤对照脑组织中miR-137的表达水平;采用免疫组织化学方法(IHC)检测上述组织标本中SPHK2、Ki-67、CD68、CD206及iNOS抗原的表达水平;分析SPHK2、miR-137与Ki-67表达水平之间的关系;SPHK2与CD68、CD206及iNOS表达水平之间的关系;分析以上各指标的表达水平与肿瘤良恶性级别的关系,明确其在胶质瘤辅助病理诊断中的意义。 2.采用Western blot检测和比较种常见胶质母细胞瘤(GBM)细胞系及人星形胶质细胞系(HA) SPHK2的表达水平;用免疫荧光技术检测U87和U251细胞中SPHK2的定位情况及表达水平。 3.利用生物信息学软件预测miR-137的靶基因并通过荧光素酶实验验证预测结果。利用miR-137 mimics转染GBM细胞系,观察miR-137对SPHK2 mRNA和蛋白含量的影响,以证实上述miRNA对靶基因表达的调节作用和机制。 4.采用克隆形成实验以及EdU细胞增殖实验等方法检测miR-137 mimics转染对GBM细胞增殖的影响;通过SPHK2真核表达质粒转染观察补充外源性SPHK2能否逆转miR-137对GBM细胞增殖的影响,探索该miRNA抑制胶质瘤细胞增殖的分子通路。 5.构建特异性敲低SPHK2的稳定胶质瘤细胞株,然后将其与巨噬细胞进行共培养后检测巨噬细胞标记物,观察其细胞极化情况。同时用蛋白芯片的方法检测SPHK2特异性敲低后胶质瘤细胞分泌细胞因子的改变情况。 6.用电镜、NTA及Western blot的方法鉴定外泌体表征;用NTA的方法分析特异性敲低SPHK2后,胶质瘤细胞分泌外泌体浓度和粒径的改变;用二代测序的方法检测特异性敲低SPHK2后,胶质瘤细胞分泌外泌体miRNA的改变并随后用PCR进行验证。 [结果] 1.ISH结果显示,各级别胶质瘤组miR-137阳性标记指数(LI%)均明显低于非肿瘤对照脑组织;IHC结果显示,各级别胶质瘤组SPHK2、Ki-67、CD68及CD206阳性标记指数(LI%)均明显高于非肿瘤对照脑组织,其中仅Ki-67随肿瘤的良恶性级别的升高而升高,而其余各指标在各级别胶质瘤间无明显差异;各级别胶质瘤组中iNOS阳性标记指数(LI%)均明显低于非肿瘤对照脑组织,且在各级别胶质瘤间无明显差异;相关分析显示,miR-137 LI%与Ki-67 LI%呈显著性负相关,而SPHK2 LI%与Ki-67 LI%、CD68 LI%及CD206 LI%均呈正相关;ROC曲线分析显示,miR-137、SPHK2、CD68及CD206均可作为胶质瘤辅助诊断的诊断标记物,其中miR-137对高低级别胶质瘤的诊断也有一定的意义。 2.九种GBM细胞系中仅A172和U118两个细胞系SPHK2的表达略低于HA细胞,其余胶质瘤细胞系中SPHK2表达水平均显著高于HA中SPHK2的表达。免疫荧光结果也显示,SPHK2在U87和U251细胞系中高表达,且主要定位于细胞核。 3.生物信息学分析及荧光素酶实验均证实在胶质瘤细胞中,SPHK2基因是miR-137的靶基因,qRT-PCR及Western blot检测结果显示miR-137 mimics转染可降低GBM细胞系SPHK2蛋白的水平,而SPHK2 mRNA水平并没有变化,证实miR-137可通过抑制SPHK2翻译过程在转录后抑制靶基因编码蛋白的表达。 4.平板克隆实验及EdU实验检测结果显示miR-137可明显抑制GBM细胞增殖,且上述效应可被补充外源性SPHK2部分逆转。 5.将胶质瘤细胞与巨噬细胞共培养后,用免疫荧光技术检测巨噬细胞M2型标记物CD206,结果显示特异性敲低SPHK2的胶质瘤细胞CD206的表达水平明显降低;用蛋白芯片检测胶质瘤细胞上清分泌的细胞因子,结果发现特异性敲低SPHK2的胶质瘤细胞分泌促M1型TAMs极化的细胞因子TNFα及IFNγ增多,而促进M2型TAMs极化的细胞因子IL-13减少。 6.NTA检测结果显示胶质瘤细胞中特异性敲低SPHK2后,其分泌外泌体浓度降低,但其粒径不变;二代测序结果显示,特异性敲低SPHK2的胶质瘤细胞分泌外泌体miR-195-5p降低,且后面的PCR也验证了这一结果。 [结论] 1.人胶质瘤组织的肿瘤细胞中普遍有miR-137表达的异常减少和SPHK2、CD68及CD206表达的异常增加;miR-137、SPHK2、CD68及CD206的表达水平均与胶质瘤密切相关,可作为辅助胶质瘤诊断重要参考指标,且上述各指标间存在相关性。 2.在胶质瘤细胞中,miR-137是SPHK2表达的重要负调节因子,miR-137表达异常减少是胶质瘤细胞中SPHK2异常过表达的重要原因,在胶质瘤发生发展和增殖行为调控中发挥重要作用。 3.在胶质瘤细胞中,SPHK2的表达水平影响胶质瘤细胞分泌细胞因子的水平,从而影响TAMs的极化。 4.在胶质瘤细胞中,SPHK2的表达水平影响胶质瘤细胞分泌外泌体的浓度及外泌体miR-195-5p的分泌,从而影响TAMs的极化。 5.本研究结果丰富和深化了对胶质瘤发生发展分子机制的认识,为胶质瘤分子病理诊断筛选了可靠的分子标记物。从比较新颖的角度外泌体出发探究胶质瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞相互作用相互影响的机制,跳出单一针对肿瘤细胞本身的治疗,着眼于肿瘤微环境,为今后开辟新的治疗靶点提供一定的科学依据。