研究背景和目的结直肠癌(colorectal carcinoma, CRC)是一种常见的恶性肿瘤,发病率呈逐年上升的趋势。临床上有一半以上的结直肠癌患者在行根治性手术前已出现了微转移,转移是导致CRC患者肿瘤复发和死亡的主要原因。因此,阐明结直肠癌转移的分子机制,筛选和鉴定结直肠癌转移中起重要作用的关键分子,对结直肠癌转移进行预测、诊断和干预对提高结直肠癌治愈率、减少死亡率具有重要意义。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段、多途径的复杂过程,每一阶段都受到多种基因、蛋白质或生物分子的调控,当前多数研究专注于癌基因、抑癌基因、转移抑制基因等相关基因在肿瘤侵袭转移中的作用和功能。近年来研究发现,除这些蛋白质编码基因能调节肿瘤的侵袭转移外,还发现一些非编码基因,如microRNA分子,也参与了肿瘤侵袭转移过程的调控。特定富含AT碱基DNA序列结合蛋白2(Special AT-rich sequence-binding protein2, SATB2)是一种重要的核基质结合蛋白,可以通过与核基质附着区(matrix attachment region, MAR)相结合,在染色体组装及基因的转录和表达调控过程中发挥重要作用。研究发现SATB2在成人脑组织中高表达,在人胎脑中等表达,在成人肝脏、肾脏、骨髓及脑的特定区域包括杏仁核、胼胝体、尾状核及海马中较弱表达。SATB2的异常与人颅面畸形有关。SATB2功能的完全丧失可导致表达SATB2的颅面部间叶组织凋亡,并引起在人和小鼠颅面部发育调节中起重要作用的Pax9、Alx4和Msx1等3个基因的表达模式发生改变。近年来,也有研究显示SATB2在骨骼发育及成骨细胞分化、大脑皮层发育中起重要作用。本课题组前期研究证实SATB2蛋白在原发结直肠癌组织中的表达水平与癌旁正常组织相比呈明显下调趋势；SATB2蛋白的表达水平与肿瘤的侵袭、淋巴结转移、远处转移及Duke’s分期相关,随着肿瘤的渐进发展过程,SATB2的表达逐渐减弱；SATB2在结直肠癌中的低表达与患者低生存率密切相关。迄今为止,在结直肠癌发生、发展中调节SATB2异常表达的关键因子尚不清楚,有待进一步阐明。基因表达调控具有多个层次,转录后调节是关键环节之一。microRNA (miRNA)是一类非编码单链小分子RNA,长约19-25个核苷酸,是近年来发现的重要转录后调控因子,可通过与靶基因mRNA的3’端非编码区(3’untranslated region,3’URT)完全／不完全互补配对,抑制靶基因表达(负性调控)。miRNA异常表达与肿瘤、发生发展密切相关。近十年来,“癌相关miRNA"已逐渐成为肿瘤发病机制探索热点,miRNA可以通过以下几个方面影响结肿瘤的发生和发展：(1)直接作为癌基因或肿瘤抑制基因(2)miRNAs参与细胞信号通路调控肿瘤细胞迁移,侵袭,细胞增殖,EMT转化,血管形成和凋亡等过程,影响结肿瘤的发展和转移。(3)miRNAs可作为肿瘤诊断和治疗的标志分子和生物靶点。目前,国内外未见关于结直肠癌中靶向调控SATB2的miRNAs报道,本研究旨在预测和鉴定靶向调SATB2基因miRNAs及其参与结直肠癌侵袭、转移的分子机制,从转录后层面揭示结直肠癌中SATB2基因异常表达的原因,从miRNA这个新的角度来理解肿瘤侵袭转移的分子机制,为结直肠癌转移的预防和治疗提供新的策略。材料与方法1、筛选靶向调控SATB2的候选miRNAs:利用TargetScan、Pictar和miRanda三个经典的miRNA靶基因预测数据库分析,结合前期miRNA芯片分析结果,共同筛选靶向调控SATB2基因结直肠的候选miRNAs。2、候选miRNA的表达检测：利用Real-time RT-PCR及原位杂交技术检测结直肠癌细胞系、组织及正常对照组织中候选miRNA的表达情况,分析miRNA和SATB2表达之间的关系及其临床意义。3、候选miRNA在结直肠癌中的功能研究：3.1预测结果的有效性：根据候选miRNAs预测结果,构建SATB2基因3’UTR野生型和突变型的报告基因载体,结合miRNA模拟物、miRNA抑制物转染和报告基因检测等技术手段,验证候选miRNA能否靶定调控SATB2基因表达,确定调控结直肠癌转移相关基因SATB2的有效miRNAs。3.2miRNA靶定抑制SATB2引起的肿瘤细胞生物学行为的变化：建立稳定过表达miRNAs的CRC细胞,通过CCK8、细胞周期、平板克隆实验观察细胞体外增殖能力的变化。用划痕实验和侵袭实验观察细胞运动和侵袭能力的变化；裸鼠皮下成瘤实验、原位可视化移植瘤实验,从体内水平观察细胞的成瘤能力和转移能力。继而,以稳定过表达miRNA的细胞株为研究对象,观察导入SATB2基因能否逆转由miRNA过表达引起的细胞生物学行为的变化。4、miRNA对细胞信号通路的影响：通过Western blot检测EMT相关分子标志物表达情况,分析miRNA、靶蛋白SATB2和EMT之间关联。5、统计学分析：所有数据采用SPSS13.0统计软件包进行统计处理,荧光定量PCR实验和侵袭实验数据用均数±标准差(means±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD法,方差不齐时使用Welch法和Dunnett’s T3法；两组间比较采用独立样本t检验(Independent-Samples T Test);结直肠配对组织样本RNA表达量检测采用配对样本T检验；双荧光素酶实验、细胞周期分析、动物成瘤实验和CCK8实验主要采用析因分析,细胞组间差异采用方差分析,时间或阶段差异分析采用独立样本T检验,取P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、筛选候选miRNA:比对分析靶向调控SATB2基因的miRNAs生物信息学预测结果和前期SW480,M5细胞的miRNA差异表达谱结果,发现miR-31、miR-27b和miR-182在M5细胞中表达水平明显升高,并且均结合于SATB23’UTR的保守区。瞬时转染miR-31和miR-182的抑制物后,M5和SW620细胞中SATB2表达增加FSW480=34.164,PSW480=0.002;FDLD1=10.344,PDLD1=0.023),miR-31和miR-182的模拟后,SW480和DLD1细胞内SATB2表达下降(FM5=29.298,PM5＜0.001；FSW620=24.165,PSW620＜0.001),而导入miR-27b的模拟物和抑制物后,细胞内SATB2表达变化不明显(P>0.05)。2、miR-31和miR-182的表达：6株结直肠癌细胞株中,niR-31和miR-182表达差异具有统计学意义(F=133.857,P＜0.001；F=13.929,P＜0.001)。转移灶来源的细胞株中(SW480/M5、 SW620和LoVo细胞)miR-31和miR-182的表达量较高(t=-2.904,P=0.044；t=-4.498,P=0.011)。结直肠癌组织中miR-31和miR-182表达明显高于配对正常组织(tmiR-31=-2.256,PmiR-31=0.038；tmiR-182=-3.907,PmiR-182=0.001),伴有淋巴结转移的癌组织中二者表达明显高于无淋巴结转移的癌组织(tmiR-31=-2.904,PmiR-31=0.044；tmi-182=-4.498,PmiR-182=0.011)。3、miR-31和miR-182对CRC细胞生物学特性的影响建立稳定过表达miR-31的结直肠癌细胞株SW480/miR-31和DLD1/miR-31;稳定过表达miR-182的SW480/miR-182和DLD1/miR-182细胞株。CCK8增殖实验：与对照细胞相比,SW480/miR-31和DLD1/miR-31细胞增殖能力明显升高(FSW480=533.400, PSW480<0.001; FDLD1=369.533, PDLD1<0.001); SW480/miR-182和DLD1/miR-182细胞增殖能力较高(F=538.553,PSW480<0.001; FDLD1=238.913; PDLD1<0.001)。平板克隆实验：与对照细胞相比,SW480/miR-31和DLD1/miR-31细胞形成克隆较多(FSW480=302.890, PSW480<0.001; FDLD1=5.851, PDLD1<0.001); SW480/miR-182和DLD1/miR-182细胞形成较多克隆(FSW480=54.157, PSW480=0.001; FDLD1=21.752, PDLD1=0.002)。细胞周期检测：过表达miR-31后,停留在G0/G1期的CRC细胞减少(FSW480=16.389, PSW480=0.004; FDLD1=11.722, PDLD1=0.008),S期细胞增多(FSW480=21.125, PSW480=0.002; FDLD1=32.967, PDLD1=0.001);过表达miR-182后,G0/G1期的CRC细胞减少(FSW480=47.257, PSW480<0.001; FDLD1=24.915,PDLD1＜0.001),S期细胞增多(FSW480=45.507, PSW480<0.001; FDLD1=25.408,PDLD1＜0.001)。裸鼠成瘤实验：与对照组相比,SW480/miR-31和SW480/miR-182细胞皮下成瘤速度增快(FSW480/miR-31=12.381, PSW480/miR-182<0.001; FSW480/miR-1824.977, PSW480/miR-182<0.001), Ki-67表达较高。体内转移实验：过表达miR-31和miR-182后,裸鼠发生腹腔转移、淋巴结转移、肝转移、肺转移；而对照细胞组裸鼠的腹腔,淋巴结、肝脏和肺部均无转移灶形成。4、荧光素酶活性检测：构建突变型SATB2基因3’UTR相关报告基因检测系统,检测发现与对照组相比,转染miR-31可以降低细胞内荧光素酶的活性,抑制SATB2的表达(F=18.721,P<0.001)；转染miR-182可以降低细胞内荧光素酶的活性,抑伟SATB2的表达(F=123.177,P<0.001)。5、SATB2可逆转miR-31和]miR-182在CRC细胞中的作用CCK8实验：转染SATB2基因后,SW480/miR-31和DLD1/miR-31细胞体外增殖能力下降(FSW480=255.452, PSW480<0.001; FDLD1=1065.112, PDLD1<0.001); SW480/miR-182和DLDl/miR-182细胞体外增殖能力下降(FSW480=1719.538, PSW480<0.001; FDLD1=553.862, PDLD1<0.001)。细胞周期：转染SATB2基因后,停留在G1/G0期的SW480/miR-31和DLD1/miR-31细胞增加(tSW480=-7.070, PSW480<0.001; tDLD1=-4.041, PDLD1<0.001),进入S期细胞减少(tSW480=2.250, PSW480=0.002; tDLD1=6.257, PDLD1=0.003);停留在G1/G0期的SW480/miR-182和DLD1/miR-182细胞G1/G0期细胞增加(tSW480=-18.160；PSW480＜0.001；tDLD1=-6.156,PDLD1=0.004),S期细胞减少(tSW480=16.378,PSW480＜0.001；tDLD1=11.718,PDLD1＜0.001)。运动和迁移能力：转染SATB2后,miR-31过表达细胞运动迁移能力下降(tSW480=9.167,PSW480＜0.001；tDLD1=9.500,PDLD1＜0.001)；miR-182过表达细胞运动能力下降(tSW480=10.698,PSW480=0.003；tDLD1=10671,PDLD1＜0.001)。6、作用机制过表达miR-31和miR-182后,SW480和DLD1细胞由圆形,立方形向多分枝,长梭形转化,细胞中上皮标志物E-Cadherin、β-Catenin表达下降,间叶标志物N-CadheriN、Vimentin表达升高；导入SATB2可增加E-Cadherin表达,降低N-Cadherin、Vimentin表达。miR-182过表达细胞内TGF-β信号传递激活,Smad3蛋白质表达增加；SPAK/JUK蛋白表达上调,MPAK通路激活；导入SATB2后, Smad3和SPAK/JUK表达降低。结论1、miR-31和miR-182在结直肠癌中高表达与结直肠癌患者淋巴结转移、远处转移以及肿瘤Dukes’分期密切相关。miR-31或miR-182是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素,过表达miR-31或miR-182的结直肠癌患者预后不良。2、miR-31和miR-182均具有促进结直肠癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭、转移的能力,在结直肠癌中具有促癌作用。3、miR-31和miR-182特异性与SATB2的3’UTR区结合,在结直肠癌细胞中负性调控SATB2的表达。4、miR-31通过抑制SATB2的表达、诱导EMT形成,促进结直肠癌的转移。5、miR-182通过抑制SATB2的表达、参与Smad信号通路和MAPK信号通路,共同调控结直肠癌细胞的增殖及转移。