论文部分内容阅读
目的从LncRNA GAS5、miR-21及其靶基因TIMP-3调控软骨基质代谢因子MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ和Aggrecan表达的角度,探讨荣筋拈痛方治疗膝骨关节炎的作用机制。方法1.SPF级8周龄雄性SD大鼠66只,改良Hulth法建立膝骨关节炎模型,并采用7.0T MRI鉴定。随机数字表法分为空白组、模型组、治疗组、对照组。空白组和模型组按1m L/（100g·d）的量给予0.9%Na Cl溶液、治疗组按0.45g/（100g·d）的量给予荣筋拈痛方水提物、对照组按0.015g/（100g·d）的量给予盐酸氨基葡萄糖胶囊水溶液,灌胃干预12周。干预后,采用7.0T MRI观察膝关节结构影像学变化,大体观观察胫骨平台关节面变化,HE染色、番红O-固绿染色观察软骨组织显微结构形态变化,RT-PCR法检测大鼠软骨组织中LncRNA GAS5的内源性表达,Real-time PCR法检测LncRNA GAS5、miR-21的表达及TIMP-3、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ、Aggrecan m RNA的表达,Western blot法检测软骨组织中TIMP-3、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白的表达。2.SPF级4周龄雄性SD大鼠42只,分批采用机械-Ⅱ型胶原酶消化法分离培养软骨细胞,并通过甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色鉴定其表型,建立大鼠软骨细胞体外培养方法。采用IL-1β诱导第二代软骨细胞,造成退变软骨细胞模型并用Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色鉴定。退变软骨细胞随机分为空白组（空白血清）、模型组（IL-1β+空白血清）、治疗组（IL-1β+荣筋拈痛方含药血清）、对照组（IL-1β+盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清）。分组干预后,Real-time PCR法检测软骨细胞中LncRNA GAS5、miR-21的表达及TIMP-3、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ、Aggrecan m RNA的表达,Western blot法测定软骨细胞中TIMP-3、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白的表达。3.采用过表达LncRNA GAS5、抑制表达miR-21和过表达miR-21慢病毒感染软骨细胞。感染软骨细胞经嘌呤霉素筛选后,分为空白组和治疗组,分别予以空白血清和荣筋拈痛方含药血清干预。干预后,Real-time PCR法检测感染软骨细胞中LncRNA GAS5、miR-21的表达及TIMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ、Aggrecan m RNA的表达。结果1.动物实验中,6周膝关节MRI,模型组内侧半月板缺如,关节积液明显,关节周围软组织肿胀,造模成功。12周膝关节MRI,模型组关节面磨损凹陷、积液明显、骨赘形成、肌肉萎缩;治疗组和对照组关节面不平整、积液量减少。胫骨平台关节面大体观,模型组关节面被结缔组织增生包裹,不可分辨;治疗组和对照组部分区域关节面尚可分辨。软骨显微结构观察,模型组软骨四层结构紊乱,排列不规律,潮线及黏合线不规则或消失,软骨细胞增生肥大且排列紊乱,软骨下骨增生,胶原、蛋白多糖大量丢失;治疗组和对照组软骨四层结构、潮线可辨,软骨细胞排列较规律,软骨下骨结构较完整,胶原、蛋白多糖部分丢失。与空白组相比,模型组软骨组织中LncRNA GAS5及MMP-3、MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5 m RNA表达量升高（P＜0.01或P＜0.05）,治疗组和对照组与模型组相比,表达量降低（P＜0.01或P＜0.05）;模型组软骨组织中miR-21及TIMP-3、CollagenⅡ和Aggrecan m RNA表达量降低（P＜0.01或P＜0.05）,治疗组和对照组与模型组相比,表达量升高（P＜0.05）。与空白组相比,模型组软骨组织中TIMP-3、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白表达降低（P＜0.01或P＜0.05）,治疗组和对照组中表达升高（P＜0.01或P＜0.05）;模型组软骨组织中MMP-3、MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5蛋白表达升高（P＜0.01或P＜0.05）,治疗组和对照组中表达降低（P＜0.01或P＜0.05）。2.细胞实验中,甲苯胺蓝染色使细胞胞核呈紫色,胞浆深蓝色,细胞整体呈蓝紫色;Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色使细胞胞浆呈棕黄色。IL-1β诱导软骨细胞退变的有效浓度为10 ng/m L,时间为24 h。荣筋拈痛方含药血清干预软骨细胞的有效浓度为10%,盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清干预软骨细胞的有效浓度为15%,时间均为48 h。与空白组相比,模型组软骨细胞中LncRNA GAS5及MMP-3、MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5m RNA表达量升高（P＜0.01）,治疗组和对照组与模型组相比,表达量降低（P＜0.01或P＜0.05）;模型组软骨细胞中miR-21及TIMP-3、CollagenⅡ和Aggrecan m RNA表达量降低（P＜0.01或P＜0.05）,治疗组和对照组与模型组相比,表达量升高（P＜0.05）。与空白组相比,模型组软骨细胞中TIMP-3、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白表达降低（P＜0.01或P＜0.05）,治疗组和对照组中表达升高（P＜0.01或P＜0.05）;模型组软骨细胞中MMP-3、MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5蛋白表达升高（P＜0.01或P＜0.05）,治疗组和对照组中表达降低（P＜0.01或P＜0.05）。3.细胞感染实验中,LncRNA GAS5、miR-21慢病毒感染软骨细胞的有效MOI均为100,感染增强试剂为Hi Trans G P。（1）与空载体组相比,LncRNA GAS5过表达软骨细胞中LncRNA GAS5表达明显升高（P＜0.01）;与空白组相比,治疗组感染软骨细胞中LncRNA GAS5及MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5 m RNA表达降低（P＜0.05）;miR-21及TIMP-3、CollagenⅡ、Aggrecan m RNA表达升高（P＜0.05）。（2）与空载体组相比,miR-21抑制表达软骨细胞中miR-21表达明显降低（P＜0.01）;与空白组相比,治疗组感染软骨细胞中miR-21及TIMP-3、CollagenⅡ、Aggrecan m RNA的表达升高（P＞0.05）,LncRNA GAS5及MMP-13、ADAMTS-5 m RNA的表达降低（P＞0.05）。（3）与空载体组相比,miR-21过表达软骨细胞中miR-21表达明显升高（P＜0.01）。与空白组相比,治疗组感染软骨细胞中miR-21及TIMP-3、CollagenⅡm RNA的表达升高（P＞0.05）,LncRNA GAS5及MMP-13 m RNA的表达降低（P＞0.05）,Aggrecan m RNA的表达升高（P＜0.05）,MMP-9和ADAMTS-5 m RNA的表达量降低（P＜0.05）。结论1.荣筋拈痛方下调膝骨关节炎大鼠软骨组织中LncRNA GAS5、MMP-3、MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5的表达,上调miR-21、TIMP-3、CollagenⅡ和Aggrecan的表达,影响软骨基质分解和合成代谢,减少软骨基质中胶原、蛋白多糖的丢失,延缓软骨基质降解,减轻软骨组织形态结构的破坏。2.荣筋拈痛方含药血清下调IL-1β诱导的退变软骨细胞中LncRNA GAS5的表达、上调miR-21及TIMP-3的表达,抑制细胞分泌MMP-3、MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5,促进细胞分泌CollagenⅡ和Aggrecan,延缓退变软骨细胞胞外基质降解。3.荣筋拈痛方含药血清干预LncRNA GAS5、miR-21病毒感染的软骨细胞,通过下调LncRNA GAS5、上调miR-21及其靶基因TIMP-3的表达,抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5表达,促进CollagenⅡ和Aggrecan表达,抑制胞外基质分解代谢、促进合成代谢,发挥延缓软骨细胞基质降解的作用。