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目的狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒引起的疾病,狂犬病的死亡率几乎100%,目前主要的保护方式是接种疫苗。纯化Vero细胞狂犬病疫苗(Purified Vero Cell Rabies Vaccine,PVRV)是目前的主流应用疫苗和人二倍体细胞狂犬病疫苗(Human diploid cell rabies vaccine,HDCV)是目前公认的安全性高的疫苗。但HDCV没有取得大规模工业化生产突破导致其价格昂贵。更长免疫持久性的PVRV是以后的研究方向加上很多发展中国家对HDCV的费用负担沉重,另外狂犬病被动免疫制剂的供应不足,及暴露后疫苗接种方案大多需要注射四或五针;兽用狂犬病疫苗接种犬只后免疫效果不佳,27%的免疫犬只中和抗体滴度不足对机体起到免疫防御效果。鉴于此,寻找一种能够增强狂犬病疫苗免疫效果的佐剂能使PVRV具有更长免疫持久性佐剂和缩短HDCV免疫方案和减少每针剂的抗原量是今后发展的主要方向,对于人用疫苗和兽用疫苗均具有潜在的商业价值。方法Cp G寡聚脱氧核苷酸(Cp G Oligodeoxynucleotides,Cp G ODN)是人工合成含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤二核酸的寡聚脱氧核苷酸序列,有关实验证实该序列是一种效果很好的免疫佐剂。本研究通过探究不同剂量的Cp G ODN的注射小鼠引起的体液免疫活性并用快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)检测抗狂犬病病毒中和抗体(Rabies virus neutralizing antibody,RVNA)效价。通过酶联免疫斑点法(Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)和实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测小鼠脾脏细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4探讨此佐剂联合狂犬病疫苗对小鼠细胞免疫应答类型。通过观察不同剂量Cp G ODN组小鼠脾脏形态变化、HE染色后的病理改变来对佐剂的安全性进行评估。以上实验研究确定在小鼠体内最佳Cp G ODN剂量后。最佳剂量Cp G ODN联合市售狂犬病疫苗抗原量和免疫程序的优化实验:分为RV组、RV+Cp G ODN组、1/2RV+Cp G ODN组、1/4RV+Cp G ODN组、1/8RV+Cp G ODN组,Essen程序免疫Balb/C小鼠,于首次免疫后第35天取血,离心分离血清进行RFFIT检测RVNA效价。Cp G ODN联合市售狂犬病疫苗免疫程序优化实验:以两针、三针、四针、五针的免疫程序,分为含佐剂两针组(0、3天)、三针组(0、3、7天)、四针组(0、3、7、14天)、五针组(0、3、7、14、28天)和无佐剂五针组(0、3、7、14、28天),抗原为狂犬病疫苗,佐剂量为最佳剂量,在免疫Balb/C小鼠后,取首次免疫后第35天的鼠血清,进行RFFIT抗狂犬病病毒中和抗体效价检测。Cp G ODN联合市售狂犬病疫苗暴露后保护效果研究,狂犬病毒标准攻击毒珠CVS-11对Balb/c小鼠攻毒后,用Cp G ODN联合不同狂犬病疫苗量(RV、1/2RV、1/4RV、1/8RV)进行ESSEN免疫程序注射,对Balb/c小鼠的暴露后保护效果进行评价。结果小鼠体内实验,Cp G ODN与狂犬病疫苗组抗体阳转率高于疫苗对照组,抗体阳转时间早于疫苗对照组。首次免疫后第35天低剂量和中剂量抗原剂量组中和抗体滴度分别提高5-6倍和3-4倍。首次免疫后第6天,低剂量Cp G ODN组激活的脾细胞分泌IFN-γ的淋巴细胞数均高于RV组,差异具有统计学意义(P<0.001)。首次免疫后第14天,Cp G ODN能增加免疫小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的淋巴细胞数量,中、低剂量Cp G ODN组分泌IFN-γ的淋巴细胞的数高于RV组,差异具有统计学意义(P<0.01)。首次免疫后14天和35天,细胞因子IFN-γm RNA的相对表达量5μg Cp G ODN组的相对表达量显著高于RV组(P<0.05)。Cp G ODN佐剂能够显著增强狂犬病疫苗的Th1型免疫应答,能够促进小鼠脾细胞的IFN-γ分泌,而Th2型免疫应答的细胞因子IL-4分泌没有明显变化。首次免疫后第14天,高剂量佐剂免疫组的小鼠脾脏肿大,HE染色后镜下观察其白髓中的动脉周围淋巴鞘增厚,易染体巨噬细胞数目增多,副皮质区易染体巨噬细胞数目增多,而低剂量和中剂量组的小鼠的脾脏无肿大,白髓及其动脉周围淋巴鞘正常且脾小体体积较小。疫苗对照组(RV)的白髓、红髓界限清晰,组织结构正常。1/4 RV+Cp G ODN组的RVNA效价略高于无佐剂的狂犬病疫苗组,1/2RV+Cp G ODN组小鼠血清的RVNA效价最高。在佐剂Cp G ODN联合狂犬病疫苗4针免疫程序下,小鼠产生RVNA效价最高。RV+Cp G狂犬病疫苗组存活率为50%,高于无佐剂疫苗对照组的存活率(30%),差异具有统计学意义。结论Cp G ODN在小鼠模型上对狂犬病疫苗有显著的免疫增效作用,并且Cp G ODN能增强狂犬病疫苗对暴露后小鼠的免疫保护效果,是一种潜在的狂犬病疫苗佐剂。