森林草莓花与叶片异常突变体基因克隆与功能解析

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二倍体森林草莓(Fragaria vesca)是蔷薇科多年生草本植物,其植株矮小、生长周期短,又因为有基因组小、易于稳定转化等特点,逐渐成为研究果实发育的理想模式植物。植物株型、花叶形态与光合作用效率、果实品质等园艺植物性状息息相关。草莓是果树中相对易于进行分子层面研究的物种,其株型等方面的调控机制却了解较少。本实验室通过EMS诱变野生森林草莓Ruegen与YW5AF7,分别得到了花叶数量增多与长度增加突变体,本研究主要以这两个突变体与其野生型为材料,通过表型鉴定、遗传分析、全基因组重测序、突变基因克隆与功能验证、转录组测序与分析以及激素相关处理等方法,解析了森林草莓株型与花叶发育的分子机制。主要结果如下:1.花叶数量增多突变体(stcl)与野生型Ruegen相比,其分枝(crown)、叶片、花、花序在数量上都有明显提高,且随生长时间加长这一变化差距逐渐增大。在回交二代(BC1F2)群体中,野生型和突变体分离比接近3:1说明stcl可能是由单基因控制的隐性突变所致,且能够稳定遗传。使用BSA的方法分析基因组重测序数据,发现Fv H4_4g31190基因在第一个外显子上第256个碱基发生了由G到A的单碱基突变造成提前终止。该突变在F2群体中突变体单株中都为纯合,暂定这一基因为调控花叶增多这一表型的致突变基因STCL。q RT-PCR检测发现该基因在stcl突变体叶片中表达量显著下调。2.序列比对发现该基因是R2R3MYB家族转录因子,但其他物种中同源性较高的基因未见功能报道。构建了STCL过表达和CRISPR载体,分别转入拟南芥与草莓,结果发现STCL-ox转基因拟南芥无明显表型变化;草莓转基因材料仍处于遗传转化阶段。3.采集stcl与野生型茎尖进行转录组测序,数据分析结果表明562个基因存在差异,且这些基因多富集在各类抗逆和胁迫应答反应中;另外,187个差异基因处于植物次生代谢和激素信号响应通路中。共有13个基因处于脱落酸合成与信号通路。推测stcl突变体可能在抗逆性方面与野生型存在显著不同。4.花叶长度增加突变体(p6)的下胚轴、叶片与花瓣都比野生型YW5AF7显著增长。遗传分析表明该突变体也是由单基因控制的隐性突变所致。混池基因组重测序分析结果显示Fv H4_1g03910基因的第2567个碱基存在将氨基酸TGG变成TGA的SNP,这一变化造成翻译提前终止。该基因表达量在p6中上调了2倍。5.序列比对发现Fv H4_1g03910在拟南芥中的同源基因为BAS1,因此命名该基因为Fve BAS1。BAS1编码油菜素内酯(BRs)代谢通路上的羟基化酶,主要负责催化BRs降解失活。亚细胞定位结果表明该基因主要存在于细胞质中。q RT-PCR结果显示BRs合成与代谢途径基因在p6叶片中都显著上调,而信号通路中基因却显著下调。外施油菜素内酯后,p6幼苗叶片卷曲和增长的表型更加敏感,而根的表型与野生型相比没有显著差异。6.构建Fve BAS1基因的过表达载体,并获得了转基因拟南芥。观察表型结果发现,转基因植株基生叶皱缩、植株矮化,与预期表型相似,说明Fve BAS1是调控草莓油菜素内酯代谢的关键基因。以上研究表明,MYB转录因子基因Fve BAS1应为stcl和p6突变体的致突变基因,在二倍体森林草莓的花叶分化与生长过程中可能起到重要作用,该结果为进一步解析草莓发育的分子机制奠定了基础。
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