第一部分高盐饮食对慢性肾衰大鼠的心脏磷酸化蛋白质组的影响研究背景慢性肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)是一种亟待解决的全球性公共健康问题,而心血管疾病(Cardiovascular disease, CVD)是影响慢性肾脏病预后的主要因素。我国透析患者CVD的死亡率为47%,是导致慢性肾衰竭患者死亡的第一位原因。慢性肾衰的心血管并发症主要包括左室肥厚(Left ventricular hypertrophy, LVH)和扩张、心肌缺血和外周血管疾病。几乎所有的终末期肾脏病患者都合并有CVD,必须引起重视的是,CVD并非仅见于终末期肾脏病患者,事实上LVH在CKD早期就已经普遍出现了,而进展至ESRD时几乎全部患者都存在LVH。LVH是确认存在心血管终末器官损害的指标之一。肾损伤是CKD患者出现临床症状的直接原因,同时还能够通过神经体液调节路径的持续激活引起左室收缩功能障碍、心脏灌注压升高和心室扩张等心血管并发症。CKD中存在的刺激因素主要包括交感神经系统的高反应性、肾素血管紧张素系统的激活、一氧化氮和活性氧簇的平衡紊乱和慢性炎症状态的维持,这些在CVD的发生发展中起到了非常重要的作用。另外,CVD也可以直接作用于肾脏,通过减少肾脏灌注和肾动脉硬化来促进慢性肾脏病的发生和发展。CVD是慢性肾脏病患者病程进展与死亡的主要原因,而高血压是CKD患者中CVD发生的显著性独立危险因素。美国国家肾脏基金会肾脏疾病预后质量计划提示,CKD患者普遍存在高血压。无论是作为引起CKD的原因还是CKD的结果,高血压都是决定肾功能水平的非常重要的独立危险因素。来自人类与动物的流行病学、干预与遗传病学的研究明确指出了血压依赖于盐摄入的关系。盐敏感个体相对盐抵抗个体更容易出现心血管系统的并发症,且都独立于传统的心血管危险因素。长期高盐摄入增加会引起明显的血压升高反应,同时也会加重高血压引起的终末器官结构和功能损害,并且这一损害并非单单由血压升高引起。基于心脏对高盐摄入反应的实验研究,发现高盐能引起动脉血压升高,同时能够引起血管纤维化、心室缺血和收缩功能障碍。蛋白质组学是研究蛋白的复杂性、用途和生物特性的技术,是以蛋白的生物多样性为基础,包括蛋白亚型、翻译后修饰(以磷酸化修饰为主)等。心脏蛋白质组学已经成为解开心血管疾病中存在的信号通路的不可缺少的技术,很多重要的心血管功能如钙平衡、心脏收缩和细胞信号转导都是通过蛋白的磷酸化与去磷酸化实现的。蛋白磷酸化信号途径的紊乱与多种心血管疾病(如心脏肥厚、缺血再灌注损伤)相关,而且蛋白质磷酸化信号分子还被作为心血管药物的靶点。尽管心血管并发症在慢性肾脏病中的重要性被广泛认识,但是相关的分子机制尚不完全清楚。本研究旨在利用磷酸化蛋白质组学的技术对慢性肾衰大鼠中心脏磷酸化蛋白进行定性和定量研究以及观察给予高盐饮食后心脏蛋白的磷酸化水平的改变,从而为探索慢性肾脏病中并发的心血管疾病的机制提供线索。研究方法一.动物模型的构建与组织样本的采集1.实验动物及饲养环境雄性Sprague Dawley大鼠(购自南方医科大学实验动物中心),体重150-180g,在SPF级环境饲养(南方医院实验动物中心),自由进水和饮食。2.慢性肾衰大鼠模型制备及其后期处理大鼠体重200g左右行左侧肾脏2/3切,一周后进行右侧肾全切(完全保留双侧的肾上腺),假手术大鼠只进行肾包膜剥离。造模期间,分别在术后4周、8周和10周通过眼眶静脉采血,检测大鼠血肌酐水平。并于第9周对大鼠进行随机分组：1) Sham大鼠+正常盐(0.4%NaCl)饮食(NS,n=6)2)5/6肾切大鼠+正常盐饮食(NC,n=6)3)5/6肾切大鼠+高盐(4%NaCl)饮食(HC,n=6)分组后,测量尾动脉血压作为基线血压。给予正常盐、高盐分别刺激14天。3.大鼠血、尿和组织样本的留取及处理3.1血压和尿样采集给予不同浓度盐饲料刺激的最后三天,代谢笼内单只单笼饲养,连续三天收集24h尿液,记录总尿量后,留取4ml尿样。并测量尾动脉血压。3.2大鼠采血及心脏灌注以3%戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采血后迅速打开胸腔,16#灌胃针从左心室穿刺入主动脉,同时剪开右心耳,4℃预冷的生理盐水(含肝素20U/ml)200ml快速灌注。3.3组织样本采集200ml预冷生理盐水灌注完毕后立即分离心脏,称重后去除心房和右心室,取左心室游离壁组织PBS反复清洗后包于锡箔纸中,液氮速冻,-80℃保存。3.4血肌酐检测采用临床自动生化分析仪检测。4.统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准误表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。两种样本均数比较采用独立样本t检验；方差齐的多种样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法,方差不齐的多种样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett’s T3法。P<0.05为差异有统计学意义。二.心脏组织的磷酸化蛋白质组学分析1.蛋白提取每组各取适量组织块样品,各组内6样品等量混合,液氮研磨,完全裂解后取上清液采用BCA法蛋白质定量。2. SDS-PAGE电泳每组取约20μg蛋白质样品,按照4：1(v/v)比例加入5X上样缓冲液进行12.5%SDS-PAGE电泳。3.酶解和肽段定量每组取约300u g蛋白样品,经过DTT还原和IAA烷基化后加入胰蛋白酶酶解,完成后OD280肽段定量4.肽段标记每组取等量肽段(约80ug),按照试剂盒：iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit (AB SCIEX)说明书进行标记,重复标记1次。将标记后的肽段溶液混合,取1/10体积的混合肽段脱盐,然后进行质谱分析。取剩余的9/10体积混合肽段真空冻干,冻干后用于二氧化钛富集。5.二氧化钛富集标记后的混合肽段溶液真空冻干,加入1×DHB buffer复溶。溶液中加入TiO2beads,振荡40min,离心,移去上清液。将beads转入具塞tip头中,加入Washing buffer1洗涤三次,加入Washing buffer2洗涤三次。加入Elution buffer洗脱,收集磷酸化肽段,真空浓缩,用20μL0.1%FA溶解,取10μL用于质谱分析。6.质谱分析6.1毛细管高效液相色谱样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC1000进行分离。6.2质谱鉴定样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。7.数据分析7.1质谱数据质谱分析原始数据为RAW文件,用软件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.3(Thermo Scientific)进行查库鉴定及定量分析。7.2数据库本次使用数据库：ipi.RAT.v3.87.fasta(发布日期2011-2-27,蛋白质序列39925条)。7.3Mascot搜索查库使用Mascot软件版本为Mascot2.2。查库时将RAW文件通过Proteome Discoverer提交至Mascot服务器,选择已经建立好的数据库,然后进行数据库搜索。7.4定量分析Proteome Discovererl.3软件根据肽段报告离子峰强度值进行定量分析。肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与其他标签的信号强度值的比值。蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数。最终定量结果再以各标签比值中位数进行归一化处理,以消除实验中人为因素引入的上样量误差。7.5Phospho RS Note质谱数据由Mascot软件搜索后,再由Proteome Discovererl.3软件对磷酸化肽段进行分析(Phospho RS score, Phosphop RS sequence probability, Phospho RS site probabilities), Phospho RS score大于50分,Phospho RS site probabilities大于75%说明磷酸化修饰的可信度较高。结果1.基础数据1.1CRF组与Sham组的基础数据大鼠造模后第9周,测量血压,称重并采集大鼠血液测定血肌酐水平,发现慢性肾衰大鼠与假手术组相比,血肌酐、动脉血压及24小时尿蛋白明显升高,而体重无明显改变(独立样本t检验,体重,t=1.559,P=0.14;血肌酐,t=-4.021,P=0.01；动脉血压,t=-2.597,P=0.02；24小时尿蛋白,t=--6.686,P=0.01)。1.2不同浓度盐刺激14天后的血生化指标高盐刺激14天后,与sham大鼠相比,CRF大鼠的心重、心重体重比、动脉血压、24小时尿蛋白明显升高,高盐加剧了这一改变,并且能够增加CRF大鼠血钠和24小时尿钠排泄(One-Way ANOVA,心脏重量,F=25.96,P=0.001；心脏/体重比值,F=49.960, P=0.000; SBP, F=13.635, P=0.001;血钠,F=7.683,P=0.004;24h尿钠,F=8.901,P=0.000;24h蛋白,F=64.782,P=0.000)。2.质谱分析结果2.1二氧化钛富集前总蛋白定性定量结果共鉴定了1877种蛋白,对其中的1830种进行了定量。正常盐组中肾衰大鼠与假手术相比226种蛋白发生了差异性改变,其中107种升高,119种降低；慢性肾衰大鼠中高盐组大鼠与正常盐组相比220种发生了差异性改变,其中120种升高,100种降低。2.2二氧化钛富集后磷酸化肽段定性定量结果2.2.1定量统计本实验通过iTRAQ技术共鉴定了1884种磷酸化肽段,其中1724种进行了定量。正常盐组中肾衰大鼠与假手术大鼠相比165种磷酸化肽段发生了差异性改变,其中89种升高,76种降低；慢性肾衰大鼠中高盐组与正常盐组相比172种磷酸化肽段发生了差异性改变,其中83种升高,89种降低。2.2.2基因本体论(Gene ontology, GO)分析采用DAVID6.7软件对检测到的763种磷酸化蛋白进行GO分类检索。这些磷酸化蛋白主要具有结合、催化活性、酶调节活性转运活性、结构分子活性、信号转导活性等功能,涉及代谢、生物过程的调节、转运、对刺激的反应、细胞生物合成、细胞通讯、细胞生长和分化等生物进程。2.2.3磷酸化位点分析采用Proteome Discoverer1.3(Thermo Scientific)软件对鉴定到的1724种磷酸化肽段进行磷酸化位点分析,1002种肽段只有1个磷酸化位点被磷酸化,2个磷酸化位点被磷酸化的共有628种,3个磷酸化位点被磷酸化的共有83种,4个被磷酸化的共有11种,其中以1个被磷酸化的占的比例最大,为58.1%,其余各占36.4%、4.8%、0.6%。再对1个磷酸化位点被磷酸化的磷酸化肽段(1002种)进行磷酸化位点类型(S/T/Y)分析,以Phospho RS site probabilities大于75%为入选标准,结果显示以pSer最为常见,为56.4%,pThr其次,占5.2%,pThy最少,占1.4%。2.2.4蛋白相互作用分析采用String软件对本次实验NC/NS组和HC/NC组检测到的140和138种差异磷酸化蛋白进行蛋白相互作用分析,发现NC/NS组中15种磷酸化蛋白(Des、Vc1、Gja1、Tnni3、Mybpc3、Myh6、Lmna、Myoz3、Tns1、Pxn、Ctnna1、 Pkp2、Dsp、Maplb、Dync1li1)能够形成网络,连接最多的2个蛋白分别是des和vcl,是慢性肾衰大鼠中心脏的磷酸化蛋白信号通路网络的中心节点。HC/NC组中23种磷酸化蛋白(Des、Vc1、Gja1、Tnni3、Mybpc3、Myh6、Myh7、Myh11、 Myh9、Ryr2、Jph2、Lmna、Vim、Myoz3、Srrm1、Srrm2、Hnrpd、Map1a、Map1b、 Khdrbs2、Hsd17b8、Eif4b、Eif3s9)能够形成网络,连接最多的3个蛋白分别是Des、Myh7和Tnni3,是给予高盐饮食后慢性肾衰大鼠的心脏的磷酸化蛋白信号通路网络的中心节点。2.2.5信号通路分析通过David在线分析软件,我们对NC/NS组与HC/NC组检测到的140和138种磷酸化蛋白所涉及到的KEGG信号通路进行了分析。发现NC/NS组中34种磷酸化蛋白(Atp2b1、Lmo7、Atp1a3、Slk、Ablim1、Adcy6、Camkk2、Ctnna1、 Des、Dsg2、Dsp、Epb4111、Flnc、 Pkp2、Pln、Pgk1、Pxn、Myh9、Myh9、Mybpc3、 Mapk14、Lmna、Rply2、Gys1、Gja1、Vc1、Tnni3、Smap2、Rp12212、Ndufv3-ps1、 Srf、Pdha1、Ppplr3d、Tjp1)涉及到钙信号转导通路、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、致心律失常性右心室心肌病、心脏肌肉收缩、肌动蛋白细胞骨架调节、醛固酮相关的钠的重吸收、胰岛素信号通路、MAPK、糖酵解／糖异生、VEGF和缝隙连接等信号通路,其功能涉及代谢、生物过程的调节等过程。HC/NC组中34个蛋白质(Crll、Blvrb、Ablim1、Ablim3、Rab4a、Pgls、Agpat2、Olr1475、 Myh9、Myh7、Myh6、Mybpc3、Mapk14、Lmna、Herc1、Hspb1、Tjp1、Slc2a4、 Hsp90ab1、Eif4b、LOC100362857、Pdha1、Pcca, Pcyt1a、LOC312502、Atp2b1、 Lmo7、Des、Dsp、Pln、Gys1、Gja1、Vc1、Tnni3)涉及到钙信号转导通路、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、致心律失常性右心室心肌病、心脏肌肉收缩、肌动蛋白细胞骨架调节、醛固酮相关的钠的重吸收、胰岛素信号通路、MAPK,糖酵解／糖异生、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、mTOR信号通路和缝隙连接等信号通路,其功能涉及代谢、生物过程的调节等过程。结论1.运用iTRAQ技术成功研究了慢性肾衰大鼠的心脏磷酸化蛋白质组学,构建了慢性肾衰大鼠的心脏磷酸化蛋白质谱,发现了与慢性肾衰并发的心脏损害相关的140种差异磷酸化蛋白,构建了15个磷酸化蛋白参与的信号网络,同时采用KEGG信号通路分析发现34个蛋白参与了肥厚型心肌病、钙信号传导等通路2.高盐使慢性肾衰大鼠的心脏中138种磷酸化蛋白的磷酸化水平发生了改变,其中23个差异磷酸化蛋白能够形成网络,34种蛋白涉及到钙信号转导通路和肥厚型心肌病等信号通路,其功能涉及代谢、生物过程的调节等过程。第二部分盐摄入与脑室内注射氯沙坦对慢性肾衰大鼠脑内OVLT的RAS的影响研究背景器官血管终板(The organum vasculosum of the lamina terminalis, OVLT)、穹窿下器官(The subfornical organ, SFO)、极后区(Area postrema, AP)共同组成室周器(Circumventricular organs, CVOs),是脑内缺乏血脑屏障的区域,OVLT是终板内整合神经体液传入信息的重要部位,它的损伤或抑制会减弱高渗或ANGⅡ引起的饮水反应、神经垂体部位抗利尿激素的分泌以及中枢性的升压反应,从而引起各种体液和心血管功能的改变。OVLT与其他脑内核团如室旁核(The paraventricular nucleus, PVN)、视上核(The supraoptic nucleus, SON)、正中视前核(The median preoptic nucleus, MnPO)、 SFO等相互联系,共同维持着体内的水电解质平衡和心血管功能的正常。肾素血管紧张素系统(The renin-angiotensin system, RAS)在慢性肾脏疾病的发生发展中起非常重要的作用。在肾病患者和肾病动物实验中,抑制ANG Ⅱ能够减少蛋白尿,降低肾损伤,并减缓发展至终末期肾脏病的速度。无论是健康还是疾病状态,RAS都是调节着体液与心血管功能重要的激素系统,包括心脏、肾脏和脑在内的很多组织都存在各自局部的RAS。脑内RAS的过度活动已被证实与自发性高血压和盐敏感性高血压动物模型的高血压发展、维持有关。脑内存在所有的RAS组分,包括renin、ACE、AGT、 ANGⅡ以及特异性AT1和AT2受体等。其中AT1受体广泛分布于脑的各个部位如PVN、SON、OVLT、MnPo、SFO、孤束核(The nucleus tractus solitarius, NTS)等,这些是调节心血管功能和水电解质平衡的重要核团。另外,有研究显示,脑室内注射氯沙坦可以逆转循环中给予ANGⅡ引起的高血压效应,提示中枢可能参与了高血压的发生发展。饮食盐的增加是促进高血压发生发展的最重要的环境因素,低钠饮食有助于CRF患者高血压的控制,增强降压药的效果,延缓慢性肾脏病的进展；而高盐摄入减弱降压药的降压效果,尤其是减弱ACEI和ARB的降压效果。本文拟选取缺乏血脑屏障并且与心血管功能和水电解质平衡调节相关的脑核团OVLT,并采用低盐(0.02%NaCl),正常盐(0.4%NaCl)、高盐(4%NaCl)饮食刺激慢性肾衰大鼠来观察盐对CRF大鼠脑内OVLT部位的RAS的影响,同时给予慢性肾衰高盐组大鼠脑室内注射氯沙坦来研究OVLT内RAS在慢性肾衰大鼠高血压发生中的作用。研究方法不同浓度盐饮食对慢性肾衰大鼠脑内OVLT的RAS的影响1.实验动物及饲养环境雄性Sprague Dawley大鼠(购自南方医科大学实验动物中心),体重150-180g,在SPF级环境饲养(南方医院实验动物中心),自由进水和饮食。2.慢性肾衰大鼠模型制备及其后期处理大鼠体重200g左右行左侧肾脏2/3切,一周后进行右侧肾全切(完全保留双侧的肾上腺),假手术大鼠只进行肾包膜剥离。造模期间,分别在术后4周、8周和10周通过眼眶静脉采血,检测大鼠血肌酐水平。并于第9周对大鼠进行随机分组：分组后,测量尾动脉血压作为基线血压。给予低盐、正常盐、高盐分别刺激14天。3.大鼠血、尿和组织样本的留取及处理3.1血压和尿样采集给予不同浓度盐饲料刺激的最后三天,代谢笼内单只单笼饲养,连续三天收集24h尿液,记录总尿量后,留取4ml尿样。并测量尾动脉血压。3.2大鼠采血及心脏灌注以3%戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采血后迅速打开胸腔,16#灌胃针从左心室穿刺入主动脉,同时剪开右心耳,4℃预冷的生理盐水(含肝素20U/ml)200ml快速灌注。3.3组织样本采集3.3.1新鲜样本200ml预冷生理盐水灌注完毕后立即分离大脑,在脑模型中将脑切成薄片,在显微镜下辨认OVLT,取出后装入0.5ml的EP管,并保存于-80℃冰箱直至蛋白提取和总RNA提取。3.3.2用于石蜡切片的样本200ml预冷生理盐水灌注后继续以4%多聚甲醛400ml灌注,完毕后取下脑,在脑模型中依据大鼠脑图谱包括且避开研究核团位置初步切成2-3mm的厚块,后固定6小时后梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,核团部位切成5μm薄片用于后续免疫组化实验。3.4血肌酐检测采用临床自动生化分析仪检测。3.5血电解质检测采用临床自动生化分析仪检测3.624h尿蛋白定量采用考马斯亮蓝-G250法检测4. Western blotting检测OVLT内RAS成分AT1受体与ACE的蛋白表达将储存于-80℃内的组织取出,称重,按组织重量：裂解液=1：4的比例加入裂解液,用5ml注射器反复吹打组织,以上操作均在冰上进行,完全裂解后,13000g,4℃,离心40min,提取上层匀浆液,即为OVLT组织的总蛋白,加入SDS(5×)上样缓冲液,95℃煮沸蛋白,Western blotting检测AT1受体与ACE蛋白的表达水平。5.免疫组织化学法检测OVLT内RAS成分AT1受体与ANGⅡ的蛋白表达取每只大鼠OVLT石蜡切片各3张,经脱蜡、梯度乙醇水化后进行免疫组织化学染色,后显微镜下200倍拍照,Image-Pro Plus软件分析,计数阳性细胞的数量。6. OVLT内RAS成分AT1受体与ACE mRNA表达的检测取各组大鼠OVLT组织放于1.5mlEP管,按组织重量：Trizol=1:10的比例进行反复吹打,提取组织总RNA,逆转录,Real time-PCR检测AT1受体与ACE mRNA的表达水平。脑室内注射氯沙坦对慢性肾衰高盐组大鼠脑内OVLT的RAS的影响7.动物模型的构建及组织样本的采集7.1实验动物及饲养环境雄性Sprague Dawley大鼠(购自南方医科大学实验动物中心),体重150-180g,在SPF级环境饲养(南方医院实验动物中心),自由进水和饮食。7.2动物模型的制备及其后期处理大鼠体重200g左右行左侧肾脏2/3切,一周后进行右侧肾全切(完全保留双侧的肾上腺),假手术大鼠只进行肾包膜的损伤。造模期间,分别在术后4周、8周和10周通过眼眶静脉采血,检测大鼠血肌酐水平。并于第9周对大鼠进行随机分组：(1)CRF+高盐饮食(HC,n=15)(2)CRF+高盐饮食+脑室内注射人工脑脊液(12μl/24h, HC+icv-CSF, n=15)(3)CRF+高盐饮食+脑室内注射氯沙坦(1mg/kg/day,12μl/24h, HC+icv-losartan, n=15)分组后测量基线血压。脑室内注射泵的植入：利用大鼠立体定位仪定位大鼠第三脑室,植入装有氯沙坦或人工脑脊液的注射泵(ALZET微渗透压泵,型号：2002,配合ALZET Brain Infusion Kit2套装)。大鼠用高盐饮食刺激14天。7.3大鼠血、尿样本的留取及组织样本的采集同上7.4血、尿样本的后续处理同上8. Western blotting检测OVLT内RAS成分AT1受体与ACE的蛋白表达同上9.免疫组织化学法检测OVLT内RAS成分AT1受体与ANGⅡ的蛋白表达同上10. OVLT内RAS成分AT1受体与ACE mRNA表达的检测同上11.统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准误表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。两样本均数比较采用独立样本t检验；方差齐的多种样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法,方差不齐的多种样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett’s T3法。P<0.05为差异有统计学意义。结果不同浓度盐饮食对慢性肾衰大鼠脑内OVLT的RAS的影响1.基本指标1.1CRF组与Sham组的血生化指标大鼠造模后第9周,测量血压,称重并采集大鼠血液测定血肌酐水平,发现慢性肾衰大鼠与假手术相比,血肌酐、动脉血压及24h尿蛋白明显升高。体重无明显改变(独立样本t检验,体重,t=1.559,P=0.14;血肌酐,t=-4.021,P=0.01；动脉血压,t=-2.597,P=0.02；24小时尿蛋白,t=-6.686,P=0.01)。1.2不同浓度盐刺激14天后的血生化指标在假手术大鼠中,与正常盐组相比,24h尿钠在高盐组中明显升高,在低盐组中明显下降,其余指标没有改变(One-Way ANOVA,体重,F=0.915, P=0.411;SBP, F=0.518, P=0.607;血钠,F=1.926,P=0.175；24h尿钠,F=136.072,P=0.000；24h尿蛋白,F=1.477,P=0.26)。在肾衰大鼠中,与正常盐相比,高盐组中除体重与血钠外,动脉血压、24h尿蛋白、24h尿钠均明显升高；而低盐组中动脉血压与24h尿钠明显降低,其余指标没有改变(One-Way ANOVA,体重,F=0.056, P=0.946; SBP, F=18.250, P=0.000;血钠,F=3.211,P=0.063;24h尿钠,F=113.316,P=0.000；24h尿蛋白,F=53.409,P=0.000)。不同浓度盐刺激14天后,低盐组中,与sham大鼠相比,慢性肾衰大鼠的24小时尿钠水平明显下降(P<0.05),其余指标未发生改变；正常盐组中,与sham大鼠相比,慢性肾衰大鼠的动脉血压和24小时尿蛋白水平明显升高(P<0.05),其余指标未发生改变；高盐组中,与sham大鼠相比,慢性肾衰大鼠的动脉血压、血钠、24小时尿蛋白明显升高(P<0.05),而24小时尿钠水平明显下降(P<0.05),体重未发生改变,体重未发生改变。2.不同浓度盐饮食对慢性肾衰大鼠脑内OVLT的RAS的影响2.1不同浓度盐饮食对慢性肾衰大鼠脑OVLT内AT1受体的蛋白和mRNA的影响2.1.1OVLT内的AT1受体的蛋白表达情况2.1.1.1免疫组化在假手术组中,与正常盐相比,虽然高盐组AT1受体表达有所升高,但是没有统计学差异,而低盐组显著降低(AT1受体IHC, One-Way ANOVA, F=26.178, P=0.001)。肾衰大鼠中,随着饮食盐浓度升高,AT1受体的蛋白表达水平上升(ATI受体IHC, One-Way ANOVA, F=98.871, P=0.000)。CRF大鼠与对应盐的sham组相比,AT1受体表达均明显升高(P<0.05)。2.1.1.2Western blotting在假手术组中,与正常盐相比,虽然高盐组AT1受体表达有所升高,但是没有统计学差异,而低盐组显著降低(AT1受体Western blotting, One-Way ANOVA,F=17.212,P=0.003)。肾衰大鼠中,随着饮食盐浓度升高,AT1受体的蛋白表达水平上升(AT1受体Western blotting, One-Way ANOVA, F=71.477, P=0.000)。CRF大鼠与对应盐的sham组相比,AT1受体表达均明显升高(P<0.05)。2.1.2OVLT内的AT1受体的mRNA表达情况在假手术组中,与正常盐相比,虽然高盐组AT1受体表达有所升高,但是没有统计学差异,而低盐组显著降低(AT1受体Realtime PCR One-Way ANOVA, F=10.535, P=0.011)。肾衰大鼠中,与正常盐相比,AT1受体mRNA在高盐组表达明显升高,在低盐组虽有所下降,但是在统计学上没有差异(AT1受体Realtime PCR, One-Way ANOVA, F=64.780, P=0.002)。 CRF大鼠与对应盐的sham组相比,AT1受体mRNA表达均明显升高(P<0.05)。2.2不同浓度盐饮食对慢性肾衰大鼠脑OVLT内ANGⅡ蛋白表达的影响在假手术组中,与正常盐相比,虽然高盐组ANGⅡ表达有所升高,但是没有统计学差异,而低盐组显著降低(ANGⅡ IHC, One-Way ANOVA, F=20.423, P=0.002)。肾衰大鼠中,随着饮食盐浓度升高,ANGⅡ的蛋白表达水平上升(ANGⅡ IHC, One-Way ANOVA, F=225.921, P=0.000)。 CRF大鼠与对应盐的sham大鼠相比,ANGⅡ表达均明显升高(P<0.05)。2.3不同浓度盐饮食对慢性肾衰大鼠脑内OVLT的ACE的蛋白和mRNA的影响2.3.1OVLT内的ACE的蛋白表达情况Sham大鼠中,与正常盐相比,低盐组的ACE蛋白表达明显下降,而高盐组虽有所升高,但没有统计学意义(ACE Western blotting, One-Way ANOVA, F=6.434, P=0.033)。肾衰大鼠中,随着盐浓度的升高,ACE的蛋白表达水平上升(ACE Western blotting, One-Way ANOVA, F=42.884, P=0.000)。 CRF大鼠与对应盐的sham组相比,ACE表达明显升高(P<0.05)。2.3.2OVLT内的ACE的mRNA表达情况在假手术组中,与正常盐相比,低盐组的ACE的mRNA表达明显下降,而高盐组虽有所升高,但是在统计学上没有差异(ACE Realtime PCR, One-Way ANOVA, F=6.434,P=0.033)。肾衰大鼠中,随着盐浓度的升高,ACE的mRNA表达水平上升(ACE Realtime PCR, One-Way ANOVA, F=42.884, P=0.000)。 CRF大鼠与对应盐的sham组相比,ACEmRNA表达均明显升高(P<0.05)。脑室内注射氯沙坦对慢性肾衰高盐组大鼠脑内OVLT的RAS的影响3.基本指标给予脑室内注射氯沙坦14天后,发现脑内注射氯沙坦组与慢性肾衰组大鼠相比,动脉血压和血钠明显降低,24h尿钠排泄明显增加,而体重、24h尿蛋白未发生变化(One-Way ANOVA,体重,F=0.116,P=0.891动脉血压,F=5.284,P=0.018；24h尿钠,F=8.420,P=0.002;血钠,F=9.037,P=0.00124h尿蛋白,F=3.232,P=0.060)。4.脑室内注射氯沙坦对慢性肾衰高盐组大鼠脑内OVLT的RAS的影响4.1脑室内注射氯沙坦对慢性肾衰高盐组大鼠脑内OVLT的AT1受体的蛋白和mRNA的影响4.1.1OVLT内的AT1受体的蛋白表达情况4.1.1.1免疫组化脑室内注射脑脊液对慢性肾衰高盐组大鼠的AT1受体的蛋白表达没有影响,而脑室内注射氯沙坦后AT1受体的蛋白表达明显下降(AT1受体IHC, One-Way ANOVA, F=93.856, P=0.000)。4.1.1.2Western blotting脑室内注射脑脊液对慢性肾衰高盐组大鼠的AT1受体的蛋白表达没有影响,而脑室内注射氯沙坦后AT1受体的蛋白表达明显下降(AT1受体Western blotting, One-Way ANOVA, F=17.334, P=0.003)。4.1.2OVLT内的AT1受体的mRNA表达情况脑室内注射脑脊液对慢性肾衰高盐组大鼠的AT1受体的mRNA表达没有影响,而脑室内注射氯沙坦后AT1受体的mRNA表达明显下降(AT1受体Realtime PCR, One-Way ANOVA, F=30.371,P=0.001)。4.2脑室内注射氯沙坦对慢性肾衰高盐组大鼠脑内OVLT的ANGII蛋白表达的影响脑室内注射脑脊液对慢性肾衰高盐组大鼠的ANGⅡ的蛋白表达没有影响,而脑室内注射氯沙坦后ANGⅡ的蛋白表达明显升高(ANGⅡ IHC, One-Way ANOVA, F=32.630,P=0.001)。4.3脑室内注射氯沙坦对慢性肾衰高盐组大鼠脑内OVLT的ACE的蛋白和mRNA的影响4.3.1OVLT内的ACE的蛋白表达情况脑室内注射脑脊液对慢性肾衰高盐组大鼠的ACE的蛋白表达没有影响,而脑室内注射氯沙坦后ACE的蛋白表达明显升高(ACE Western blotting, One-Way ANOVA, F=5.255,P=0.048)。4.3.2OVLT内的ACE的mRNA表达情况脑室内注射脑脊液对慢性肾衰高盐组大鼠的ACE的mRNA表达没有影响,而脑室内注射氯沙坦后ACE的mRNA表达明显升高(ACE Realtime PCR, One-Way ANOVA, F=40.436, P=0.000)。结论1.慢性肾衰大鼠OVLT内存在局部RAS的活化,高盐饮食进一步活化了慢性肾衰大鼠OVLT局部的RAS；2.脑内OVLT的RAS参与了慢性肾衰大鼠摄入高盐后引起的升压反应。