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人生长激素(hGH)是由下丘脑垂体前叶所分泌的一种重要的蛋白质激素,在细胞增殖和代谢等多种生命活动中发挥着关键作用,主要用于治疗矮小症。目前,市场上重组人生长激素(rhGH)的造价高,临床治疗也存在着各种各样的缺陷,比如依从性差、活性低、出现过敏等不良反应。因此,获取高表达量、高活性的rhGH对于降低工业生产成本和提高临床药效具有重要意义。针对目前存在的问题,本课题围绕生长激素开展了以下四个方面的研究:1.生长激素的基因筛查我们从部分人群的漱口水样本中,对编码生长激素的基因进行了初步筛查,结果表明,样品中编码生长激素的外显子碱基序列相同,提示人生长激素基因序列具有相对的保守性。因此,生物合成人源的生长激素并进行外源性补充具有重要意义。2.重组人生长激素在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化和结构表征为了提高rhGH的体外表达量,我们在hGH基因的N端插入了引导肽序列,成功构建了rhGH分泌型表达菌株,并实现了可溶性表达。经过培养条件优化后,得到了表达量为800μg/m L的rhGH,其纯度可达90%以上;对rhGH进行了SDS-PAGE、Western blot、HPLC、CD和蛋白质质谱分析,证明表达的蛋白与天然人生长激素的结构一致。3.生长激素突变体在大肠杆菌中的表达、纯化及结构表征为了获取高活性的rhGH,我们对hGH的三维结构中关键的氨基酸残基进行了定点突变,成功克隆了6个突变体基因,并获得6种生长激素突变体蛋白。基因测序、Western blot和蛋白质质谱分析结果表明,突变体蛋白的序列正确,突变成功。4.重组人生长激素及其突变体的活性研究我们采用细胞和斑马鱼模型,对野生型和突变型生长激素进行了活性评价。与野生型相比,突变体F176Y和Q46W对MC3T3-E1细胞具有更强的促增殖作用;同时,对斑马鱼节间血管和肠下血管也具有更强的促生长作用。小结:本论文通过初步的基因筛查,发现人生长激素基因序列具有相对的保守性,提示补充外源性生长激素具有重要的意义;报道了一种简单有效的方法,可用于rhGH在大肠杆菌中克隆、表达和纯化。本文成功在大肠杆菌细胞周质中实现了野生型rhGH及其六种突变体的可溶性表达并进行了相关活性研究,其中突变体F176Y、Q46W表现出良好的生物活性。本课题为rhGH的工业化生产奠定了基础,也为生长激素突变体设计提供了理论依据。