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研究目的:1、通过比较健康人与TB患者、不同严重程度的TB患者、治疗前后的TB患者外周血LDGs的水平,明确LDGs水平与TB的相关性。2、分析LDGs及NDGs的分子表型及凋亡、活化水平,探讨LDGs的分化状态。3、通过体外感染实验验证Mtb感染与LDGs产生的相关性及LDGs的来源。4、通过体外实验探讨LDGs形成的相关机制。5、通过吞噬和杀菌实验,初步探讨LDGs在抗Mtb感染中的作用。研究方法:1、分别收集健康人和TB患者外周血标本,进一步将TB患者按痰涂片抗酸染色结果分为抗酸阳性、阴性两组,按抗结核药物治疗时间分为治疗前、治疗2周、治疗6月三组,流式细胞术分析外周血PBMC层中LDGs的比例。2、LDGs及NDGs分子表型及凋亡、活化水平检测:流式细胞术检测LDGs表面CD15、CD16、CD33、CD66b、CD62L的表达水平及凋亡坏死率、ROS水平。3、Mtb感染与LDGs产生的相关性验证及LDGs的来源探讨:(1)采用H37Rv以不同感染比例感染健康人外周血,于不同的时间点采用流式细胞术检测LDGs占PBMC层的比例;(2)采用不同毒力的分枝杆菌感染健康人外周血,采用流式细胞术检测LDGs占PBMC层的比例;(3)分离纯化健康人外周血中性粒细胞,以H37Rv按不同感染比例感染中性粒细胞,4h后采用Ficoll密度梯度离心法分离LDGs和NDGs,牛鲍计数板分别计数后,计算LDGs占总中性粒细胞的比例。4、从凋亡水平探讨LDGs的形成机制:分别在不干预和凋亡抑制条件下采用H37Rv感染健康人外周血,分别作用T=4h、15h后检测LDGs产生的水平。5、从ROS水平探讨LDGs的形成机制:分别在ROS促进(PMA处理)和ROS抑制(NAC处理)条件下采用H37Rv感染健康人外周血,探讨ROS对LDGs产生的影响。6、LDGs的功能探讨:(1)采用流式细胞术对比TB患者外周血LDGs和NDGs对Mtb的吞噬能力,以及体外诱导形成的LDGs和NDGs的吞噬功能。(2)采用H37Rv分别感染LDGs和NDGs,于不同的时间点裂解细胞进行H37Rv的培养、计数,探讨LDGs和NDGs对H37Rv的杀菌功能。研究结果:1、TB患者外周血中LDGs的比例显著高于健康对照组;痰涂片抗酸阳性的TB患者LDGs的比例显著高于抗酸阴性者;TB患者经抗痨治疗后,外周血LDGs的比例随治疗时间延长而下降,治疗两周后,LDGs的比例显著降低,治疗6个月后与健康对照组无明显差异。2、与NDGs相比,TB患者LDGs表面CD15、CD33、CD66b表达量显著升高,CD62L的表达量显著下降,凋亡率上调,ROS水平上调。3、体外分枝杆菌感染可显著上调健康人外周血中LDGs的水平。分枝杆菌诱导LDGs生成的能力具有时间和感染剂量依赖性,并与分枝杆菌的毒力和活力相关。采用Mtb感染健康人外周血中纯化成熟中性粒细胞同样能诱导LDGs的生成。4、中性粒细胞的凋亡水平与LDGs生成比例无直接相关性。5、采用PMA上调中性粒细胞的ROS水平可显著上调LDGs的生成水平,相反,采用NAC抑制中性粒细胞的ROS水平则显著下调Mtb感染后LDGs的生成水平。6、与NDGs比较,LDGs吞噬功能增强,杀菌功能无明显差异。研究结论:1、LDGs水平在TB患者外周血中显著上调,且与TB的严重程度相关;2、结核病患者外周血中的LDGs为一群发生脱颗粒的活化中性粒细胞,与NDG比较具有较强的吞噬Mtb的能力,但对Mtb的杀伤能力无显著差异;3、Mtb体外感染健康人外周血可诱导LDGs的生成,并可诱导纯化的成熟中性粒细胞向LDGs转化,提示LDGs可能来源于中性粒细胞的原位活化;4、LDGs的产生与中性粒细胞的ROS水平相关,通过调节ROS水平可调控Mtb感染过程中的LDGs水平。