细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid，TeA，化学名，3-乙酰基-4羟基-5-仲丁基吡咯啉-2-酮)是链格孢霉代谢物中毒性最大的毒素，易污染高粱、玉米、小麦、油菜籽、葵花籽、番茄和苹果等农作物。人摄入被TeA污染的食品后可导致急性或慢性中毒。免疫分析法，作为仪器法的一种补充方法，具有通量大，检测成本低等优点，越来越受到食品安全领域研究者的重视。在免疫分析法中，抗体的质量非常关键，基因工程抗体作为第三代抗体，具有易改造、制备周期短、可发酵生产等优点。核糖体展示技术是一种体外展示技术，不受细菌转化效率、噬菌体包装、跨膜分泌和蛋白酶降解等因素影响，是一种快速淘筛抗体的技术。本论文以TeA为研究对象，合成人工抗原免疫小鼠，基于小鼠脾细胞构建单链抗体库并利用核糖体展示技术对其进行亲和富集，富集后的抗体库构建融合表达载体，进而表达、筛选特异性抗体。主要研究方法和结果如下：　　 (1)TeA人工抗原的合成及动物免疫　　 以异亮氨酸为原料，合成TeA，其与水合肼反应合成带氨基的半抗原TeAH，将其与乙醛酸反应合成手臂更长带羧基的半抗原TeAHGA。经质谱与核磁共振鉴定，TeA及其半抗原合成成功。将半抗原TeAHGA和TeAH分别与载体蛋白偶联，制备人工抗原免疫小鼠，间接ELISA和间接竞争ELISA检测小鼠抗血清免疫效果。结果表明，B鼠抗血清效价为1:128000，对TeAH的半抑制浓度(IC50)为78.33ng/mL，其脾细胞作为制备抗体库的材料。　　 (2)抗TeA核糖体展示单链抗体库的构建及鉴定　　 Trizol法抽提上面小鼠脾细胞总RNA，反转录合成cDNA第一链，以重轻链混合引物分别扩增抗体重轻链可变区基因库。扩增产物与载体pEASYT3连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB平板。从重链库和轻链库中分别随机挑5个白斑酶切和测序鉴定，进行基因序列分析。结果表明，抗体重链库可变区大约为360bp和轻链库可变区大约为320bp，5个重链克隆和5个轻链克隆都含有插入片段，抗体重链基因均由V、J、D胚系基因重排而成，与鼠源胚系基因的同源率在80％以上，成功获得符合要求的重链可变区基因库；抗体轻链基因均由V、J胚系基因重排而成，与鼠源胚系基因的同源率在80%以上，成功获得符合要求的轻链可变区基因库；5个重链氨基酸和5个轻链氨基酸序列的同源率分别为31.7%和43.8%，成功获得多样性较好的抗体可变区基因库。以符合要求的重轻链库为模板，扩增带接头区的可变区基因库，成功获得带接头的抗体重链可变区基因库大约为360bp和轻链可变区基因库大约为350bp。以质粒pDGFP(2H)为模板扩增linker区，成功获得大约80bp的linker区。以人源轻链恒定区为模板扩增间隔区，成功获得大约300bp的间隔区。将各基因片段进行重叠延伸PCR构建核糖体展示单链抗体库，成功获得大约1100bp的核糖体展示单链抗体库，库容量为1.85×1012。　　 (3)利用核糖体展示技术对抗TeA单链抗体库进行亲和富集　　 利用TNT T7 quick for PCR DNA系统为体外转录翻译系统，比较大分子屏蔽、抗原交叉包被、不同包被抗原浓度对抗体库富集效果的影响。第三轮富集之后，在体外转录翻译后的体系中加入不同浓度的小分子药物进行竞争，监测抗体库是否进行特异性富集，同时比较各轮富集后抗体库特异性条带浓度。结果表明，每轮核糖体展示富集结束，在大约1000bp处出现特异性DNA条带；在进行竞争性富集时，随着竞争药物浓度降低目标条带亮度越高，单链抗体库得到特异性富集；第三轮富集之后，特异性DNA抗体库回收浓度为83.3ng/μL，是第一轮核糖体展示富集DNA浓度的1.5倍，表明抗体库经3轮展示之后进行了富集，核糖体展示成功。　　 (4)融合蛋白表达载体的构建、表达及特异性抗体筛选　　 以第三轮展示富集后的单链抗体库为模板，引入sfiI和NotI酶切位点，与经同样双酶切的表达载达pLIP6-GN连接，电转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性率。结果表明，目的基因库片段大小约为750bp，菌落PCR鉴定阳性率为100%。挑235个克隆到2×YT培养基中培养，利用IPTG进行诱导表达，细菌培养上清用于检测酶活，菌体沉淀用bugbuster抽提周质腔蛋白，直接竞争ELISA检测特异性。结果表明，235个克隆均可以表达融合蛋白，1个克隆对TeAH有特异性(a204号)。挑特异性克隆于2×YT-AG培养基中培养至不同的细菌密度，加入IPTG诱导表达过夜，超声破碎细胞，Western blotting分析蛋白是否表达、SDS-PAGE比较不同诱导时期融合蛋白表达量、直接竞争ELISA检测融合蛋白效价和灵敏度。结果显示，与对照相比在大约75kDa处出现一条新的蛋白表达条带，融合蛋白表达成功；当细菌密度(A600nm)在0.6～0.7之间开始诱导表达，融合蛋白表达量最高；其周质腔提取物效价为1:64，IC50为8.46ng/mL，最低检测限为1.03ng/mL，线性范围为1.44～75.29ng/mL。　　 (5)抗TeA单链抗体生物信息学初步分析　　 根据测序结果，找出抗体起始引物的位置，在IMGT/V-QUEST数据库中对抗体编码区序列进行DNA序列分析和氨基酸序列推导，并在NCBI数据库中预测抗体二级结构和三维结构。结果表明，抗体重链可变区为354bp，linker区为60bp，轻链可变区为321bp；重链基因由胚系基因V-J-D基因重排构成，与鼠源胚系基因的同源率分别为98.61%和94.23%；轻链基因由胚系基因V-J基因重排构成，与鼠源胚系基因的同源率分别为93.12%和89.19%；抗体分子量为25733.3，共有245个氨基酸残基组成，等电点为5.64，抗体的分子式为C1124H1731N301O376S8；抗体二级结构中含α螺旋13处，β转角23处，β折叠93处，随机卷曲118处；三维结构符合典型的单链抗体结构特征，由六个环区组成抗原结合区