骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤,尤以15-19岁的青少年多见,其发病率为4／百万,且男性患病率约为女性的1.4倍。目前临床治疗骨肉瘤除手术切除外,化疗仍以阿霉素(ADM)、顺铂(CDDP)、甲氨蝶呤(MTX)为主,随着新辅助化疗的发展,患者5年生存率已上升到65-75%。尽管如此,对于治疗骨肉瘤新药的研发却少之又少,而且,对于肺转移和复发的患者,其预后更差,至今尚无有效可行的方案。因此,研发高效低毒的新型抗骨肉瘤药物或化疗增敏药物,可作为目前骨肉瘤治疗中的一大方向。伏立诺他(辛二酰苯胺异羟肟酸,SAHA)是第一个于2006年经美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准用于临床治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)类药物,它可通过诱导细胞分化、阻断细胞周期、诱导细胞调控而发挥作用。顺铂(cisplatin, CDDP),是一种细胞周期非特异性药物,其可通过抑制肿瘤细胞的DNA复制,损伤肿瘤细胞膜的结构,而发挥着较强的抗癌作用并被广泛应用于临床,同时它也是治疗骨肉瘤的一线化疗药物。鉴于新药研发的困难和应用增敏药物的启示,以及两类药物的作用原理,我们设计了联合用药的相关课题,本课题将通过以下三部分来探讨：SAHA与CDDP联合作用后对骨肉瘤细胞的增殖抑制情况；体内抑瘤效果；以及二者作用的可能分子机制。这对进一步揭示骨肉瘤的发病机制具有重要意义,并为骨肉瘤患者的临床治疗带来新的思路。本实验研究主要分：一、通过实验得出不同细胞株对SAHA与CDDP作用后在有效联合指数(CI)下的作用浓度,在此浓度前提下观察药物联合对细胞的增殖抑制、周期阻滞以及凋亡与自噬；二、在第一部分的基础上,我们建立了骨肉瘤的异位移植动物模型,并将SAHA与CDDP联合应用于裸鼠,观察对骨肉瘤的抑瘤效果；三、着重探讨二者联合作用后可能的分子机制。本论文的研究结果表明：SAHA显著增加了CDDP对骨肉瘤细胞抑制的敏感性,因此,在减少CDDP应用剂量的同时,也降低了其毒副作用。第一部分SAHA联合CDDP对骨肉瘤细胞增殖抑制的研究目的：观察二者联合后对骨肉瘤细胞的增殖抑制以及细胞周期变化,凋亡与自噬。方法：通过细胞增殖抑制试验(MTS)来观察对骨肉瘤细胞(HOS和U20S)的增殖抑制效果；通过流式细胞仪(FCM)来分析细胞周期阻滞与凋亡的变化,通过透射电子显微镜(TEM)来观察细胞自噬的情况。结果：SAHA联合CDDP后可显著抑制HOS与U20S细胞的增殖,联合组与对照组相比有显著性差异(P<0.05),而对正常的人成骨细胞(hFOB)抑制作用较弱；同时引起细胞S期阻滞,细胞凋亡比例明显增加；诱导了自噬小体的形成。结论：SAHA增敏了CDDP对骨肉瘤细胞株HOS与U20S的增殖抑制作用,但对hFOB细胞抑制较弱；诱导了自噬的发生。第二部分SAHA联合CDDP对荷瘤裸鼠的体内抑瘤效果研究目的：观察SAHA联合CDDP对异位骨肉瘤裸鼠模型的抑瘤效果方法：首先应用HOS细胞株建立骨肉瘤的裸鼠皮下移植瘤模型,并将动物分为四组：对照组、SAHA组、CDDP组和SAHA+CDDP联合治疗组,后经腹腔注射给药,观察裸鼠体重和肿瘤体积变化。结果：SAHA+CDDP联合组显著抑制了肿瘤的生长,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),而体重在CDDP单药组和联合组均出现了先降低后逐渐回升的变化趋势。结论：在裸鼠体内同时应用SAHA与CDDP,可显著抑制肿瘤生长。第三部分SAHA联合CDDP抑制骨肉瘤细胞增殖的分子机制研究目的：探讨SAHA联合CDDP作用于骨肉瘤细胞引起凋亡与自噬相关信号通路的变化方法：应用FCM检测活性氧(ROS)的变化,real-time PCR检测相关周期基因的变化,Western Blot检测凋亡(Caspases)信号通路、内质网应激(ER stress)信号通路以及自噬相关蛋白的变化。结果：应用抗氧化剂(NAC)后,可部分抵抗二者联合对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用；SAHA联合CDDP引起了周期相关基因CyclinA2、CyclinE、CDK2、p21的变化,使得p21和CDK2表达增加,CyclinA2和CyclinE表达减少。Western Blot结果示：Caspases家族蛋白表达增加；ER stress相关蛋白PERK与eIF2α变化不明显；自噬蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的比例增加而且加入自噬抑制剂3-MA和CQ后,凋亡蛋白表达增加。结论：在引起骨肉瘤细胞凋亡的过程中ROS参与其中,以经典的Caspase凋亡信号通路为主；二者联合后促进了自噬的形成；同时,对ER stress的影响甚微；根据凋亡与自噬蛋白的表达变化关系：抑制自噬而增加凋亡,说明：自噬在其中扮演了部分保护的角色。