目的:胰腺癌是人类消化系统的高度恶性肿瘤,是全球第五大常见癌症和第二大癌症相关死亡原因。胰腺导管腺癌(PDAC)来源于胰腺导管上皮细胞,占所有胰腺患者的80%。目前,手术切除是治疗PDAC患者最有效的治疗方法,然而,大多数患者诊断时已处于转移阶段而无法进行手术。近几年,尽管在诊断技术和治疗策略上有巨大的进步,但是PDAC患者的预后仍然很差,5年的存活率不到5%。PDAC的侵袭性生物学行为和不良的临床预后其潜在存在的机制尚未被阐明。因此,研究PDAC的发生和发展的潜在机制对于发现有效治疗方法至关重要。长链非编码RNAs(IncRNAs)是一组长度大于200个核苷酸的非蛋白编码转录本。IncRNAs被认为是一种通过多种机制发挥作用的新型基因调控因子,包括microRNA(miRNA)的竞争,转录调节,染色质重构和组蛋白修饰。现有证据表明,IncRNAs参与了多种生物学行为的调控,包括细胞衰老、分化、代谢、生存、凋亡和肿瘤发生。在PDAC研究领域,已知有许多IncRNAs异常表达,其异常表达对PDAC的恶性特性具有重要作用,因为这些IncRNAs具有促癌或抑癌分子的功能。MicroRNAs(miRNAs)是一类由17-24个核苷酸组成的内源性非编码短链RNA分子家族。MicroRNAs是基因表达的主要调控因子,因为他们通过碱基配对与它们的目标靶mRNAs结合,从而导致目标mRNAs的翻译抑制和/或降解。研究发现,miRNAs的异常表达在PDAC的发生发展过程中起到致癌或抑癌的作用,并且在广泛的生物过程中发挥关键作用。IncRNA-介导的肿瘤行为依赖于IncRNAs和mRNAs之间的相互作用,它们相互竞争miRNAs中共享的结合区域。这种相互竞争的内源性RNA(ceRNA)机制引起了人们对多种人类恶性肿瘤发生发展的研究兴趣。因此,研究与PDAC相关的IncRNAs的具体作用可能为抗癌治疗提供一个新的、有效的靶点。近年研究表明,LINC00657在各种人类癌症中异常调节,且有促进肿瘤进展的作用,例如非小细胞肺癌(NSCLC),食管鳞状细胞癌(ESCC),胶质母细胞瘤,结肠癌以及肝癌。然而,据我们所知,关于LINC00657在PDAC中的表达情况及其参与的研究罕见报道。因此,在本研究中,我们首先检测了LINC00657在PDAC肿瘤及细胞系中的表达情况。然后,我们进行了功能学实验来检测LINC00657在PDAC恶性肿瘤进展过程中的生物学功能以及相关的下游分子机制。研究方法:我们收集了中国医科大学附属第一医院56例经手术切除治疗的胰腺导管腺癌患者的肿瘤组织及癌旁正常胰腺组织,这些病人未进行放化疗或手术前的其他抗癌治疗。首先应用实时定量PCR技术(RT-qPCR)对56对PDAC组织及癌旁组织以及四种PDAC细胞系和人正常胰腺细胞系HPDE6c7中LINC00657的表达情况进行检测;利用统计学分析(包括:卡方检验法和Kaplan-Meier法)LINC00657表达水平与PDAC的临床病理分析因素、患者预后情况之间的关系;之后,在PDAC细胞系中向下调控LINC00657的表达,利用CCK-8实验、Transwell实验、流式细胞术实验以及裸鼠皮下移植瘤实验检测LINC00657在体内外对PDAC细胞增殖、迁移、侵袭以及凋亡能力的影响;接下来,我们通过核浆分离、RT-qPCR实验对LINC00657在PDAC细胞中的定位情况进行检测,然后应用生物信息学预测了LINC00657的靶miRNA miR-433以及miR-433的靶mRNA PAK4。通过荧光素酶报告基因、RIP实验和RT-qPCR检测LINC00657对miR-433表达水平的影响、二者的结合情况以及miR-433和PAK4在PDAC细胞系、组织及癌旁组织表达水平,利用蛋白免疫印迹法(western blotting)对PDAC细胞系中PAK4的蛋白水平进行检测,经Spearman’s相关性分析PDAC中LINC00657与miR-433的相关性以及miR-433与PAK4的相关性,采用卡方检验和Kaplan-Meier法分析miR-433表达水平与PDAC的临床病理分析因素、患者预后情况之间的关系;通过在PDAC细胞系中向下调控LINC00657的表达的同时向上或向下调控miR-433的表达或向上调控PAK4的表达,利用RT-qPCR、功能学实验(包括:CCK-8实验、Transwell实验、流式细胞术实验)检测LINC00657、miR-433和PAK4三者竞争性结合的关系以及三者交互作用对PDAC细胞增殖、迁移、侵袭以及凋亡能力的影响。后采用spss22.0统计分析软件对实验数据进行分析,P<0.05说明结果具有统计学意义。结果:1.我们发现LINC00657在PDAC细胞系(4/4)中均表达增多,在56例配对PDAC组织中LINC00657表达水平明显高于其配对的癌旁组织。并且LINC00657的高表达与PDAC的病理T分期以及淋巴结转移密切相关。同时,Kaplan-Meier分析显示PDAC患者中LINC00657高表达组的总生存期要低于LINC00657低表达组。2.我们在LINC00657高表达的PDAC细胞系Panc-1和Sw1990中敲除LINC00657,分别通过体外以及体内功能学实验(CCK-8实验、Transwell实验、流式细胞术实验以及裸鼠皮下移植瘤实验)均证实敲减LINC00657抑制PDAC细胞增殖、迁移和侵袭能力,并且促进了其凋亡。3.在LINC00657影响PDAC恶性表型的分子机制方面,我们检测了miR-433在PDAC中的表达明显减少,LINC00657和miR-433的表达均主要定位于细胞质中,并且miR-433的表达与LINC00657的表达呈负相关,我们还发现LINC00657有miR-433的结合位点,通过结合位点与miR-433直接结合。经检测我们发现PDAC细胞中miR-433还可以直接与目标靶mRNAPAK4的3’-UTR结合,因此三者竞争性结合且三者交互作用进而影响PDAC的恶性表型。最后,挽救实验证实了LINC00657通过作为一个竞争的内源性RNA(ceRNA)竞争性结合miR-433从而导致PAK4表达增加进而影响PDAC的恶性程度。结论:1.LINC00657在PDAC组织及细胞系中的表达是上调的;2.体内外实验证明了敲减LINC00657后抑制了PDAC细胞的增殖、迁移以及侵袭能力并且促进了细胞凋亡能力;3.LINC00657在PDAC细胞中充当miR-433的一个分子海绵;4.在PDAC细胞中,PAK4是miR-433的一个目标靶基因;5.抑制miR-433-PAK4轴从而使得PAK4增多会减弱由于LINC00657减少导致对PDAC细胞的影响。这些结果表明LINC00657-miR-433-PAK4介导的靶向性可能是预防或治疗PDAC患者的有效方法。