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背景与目的肠缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤是由急性肠系膜缺血、肠梗阻和肠移植等多种病理生理因素引起的临床常见事件;由于其发病隐匿,缺乏有效的治疗手段,故死亡率很高,探究减轻肠I/R损伤的策略对改善器官恢复和患者生存具有重要的意义。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对包括肠I/R损伤在内的多种损伤具有积极的作用,研究发现BMSCs的这种作用主要与其分泌的外泌体(BMSCs-derived exosome,BMSC-exo)有关,然而,BMSC-exo在肠I/R损伤中的作用目前尚不明确。外泌体可携带mi RNA通过靶向基因调控多种生物学过程,mi R-144-3p被发现在BMSC-exo中呈高表达水平,且其与缺血缺氧的生理过程密切相关。mi R-144-3p可负性调节PTEN表达,而PTEN介导的Akt/Nrf2抗氧化应激途径对减轻肾I/R损伤具有重要作用。但是,BMSC-exo能否通过mi R-144-3p调节PTEN/Akt/Nrf2信号通路从而减轻肠I/R损伤还有待进一步探究。故本实验拟就BMSC-exo对肠I/R损伤的作用做深入研究,并基于mi R-144-3p和PTEN/Akt/Nrf2信号通路探讨其可能的机制。方法1.取C57BL/6小鼠股骨和胫骨中的骨髓,贴壁细胞培养法培养BMSCs,观察BMSCs的形态,流式细胞术检测BMSCs中的CD29、CD34、CD45和CD105表达,鉴定BMSCs的成骨、成脂和成软骨分化能力。超速离心法从3-6代的BMSCs培养上清液中提取外泌体,利用透射电镜、纳米颗粒追踪分析仪及Western blot对外泌体进行鉴定。2.将PKH-67标记的外泌体与DAPI标记的肠上皮细胞(Intestinal epithelial cell-6,IEC-6)共培养6 h、12 h、24 h,观察外泌体在ICE-6细胞中的摄取情况。IEC-6在细胞培养箱中进行12 h的缺氧和6 h的复氧培养,建立细胞氧-糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,将IEC-6细胞随机分为对照组、OGD/R组和BMSC-exo组(除对照组外,其余各组均建立OGD/R模型),给予相应处理,CCK-8法检测各组细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡率、ELISA法检测SOD、MDA和ROS的表达水平、Western blot检测IEC-6细胞中PTEN、Akt、p-Akt和Nrf 2的表达水平。将C57BL/6小鼠肠系膜上动脉结扎45 min后恢复灌注2 h,以建立小鼠肠I/R损伤模型,小鼠随机分成对照组、I/R组、I/R+MSC组、I/R+MSC-exo组、I/R+MSC-GW4869(GW4689是外泌体生物发生/释放的抑制剂)5组(除对照组外,其余各组均建立肠I/R损伤模型);给予相应处理,HE染色观察各组小鼠肠组织病理损伤并用Chiu’s评分评价损伤程度、TUNEL检测肠组织凋亡情况、ELISA法检测SOD、MDA、ROS、DAO和TNF-α的表达水平、Western blot检测各组小鼠肠组织中PTEN、Akt、p-Akt的表达、免疫荧光染色测定肠组织中Nrf2的表达。3.RT-PCR检测mi R-144-3p在对照组、OGD/R组和BMSC-exo组中的表达水平。双荧光酶报告验证mi R-144-3p与PTEN之间的靶向调节关系。基因转染技术将mi R-144-3p mimic/NC mimic和mi R-144-3p inhibitor/NC inhibitor转染到BMSCs并提取得到相应外泌体。IEC-6细胞随机分为对照组、OGD/R组、OGD/R+WT-Exo组、OGD/R+NC mimic-Exo组、OGD/R+mi R-144 mimic-Exo组、OGD/R+NC inhibitor-Exo组、OGD/R+mi R-144 inhibitor-Exo组7组(除对照组外,其余各组均建立OGD/R细胞模型);小鼠随机分为对照组、I/R组、I/R+WTExo组、I/R+NC mimic-Exo组、I/R+mi R-144 mimic-Exo组、I/R+NC inhibitor-Exo组、I/R+mi R-144 inhibitor-Exo组7组(除对照组外,其余各组均制备肠I/R模型);给予相应处理后,检测各组细胞活力、肠组织病理学损伤、肠组织细胞凋亡情况、各组细胞和肠组织中SOD、MDA、ROS、DAO和TNF-α的表达以及PTEN、Akt、p-Akt和Nrf 2的表达(相关检测方法同上所述)。结果1.BMSCs呈梭状、纤维状和不规则形状;茜素红S染色、油红O染色和阿利辛蓝染色证实BMSCs具有成骨、成脂和成软骨细胞分化能力;BMSCs中CD29和CD105表达阳性,CD34和CD45表达阴性。BMSC-exo呈圆形或椭圆形;平均粒径为79.70 nm;表面标志物TSG101、CD63和CD9均呈阳性表达。2.在6 h、12 h和24 h均在IEC-6细胞中观察到外泌体存在。与OGD/R组相比,BMSC-exo显著提高细胞活力、增加细胞中SOD、p-Akt和Nrf 2的表达(P<0.05);减轻细胞凋亡、降低MDA、ROS和PTEN的表达水平(P<0.05)。与I/R组相比,BMSC-exo显著减轻肠组织病理学损伤、减少肠组织细胞凋亡、降低MDA、ROS、DAO、TNF-α和PTEN的表达(P<0.05);上调SOD、p-Akt和Nrf 2的表达(P<0.05);GW4869的应用逆转了BMSCs对这些指标变化的影响(P<0.05)。3.与对照组相比,OGD/R组中mi R-144-3p的表达显著降低(P<0.001)。mi R-144-3p靶向并负性调节PTEN的表达。与OGD/R组和I/R组相比,WT-exo、NC mimic-Exo、mi R-144 mimic-Exo、NC inhibitor-Exo、mi R-144 inhibitor-Exo均显著提高细胞活力、细胞及肠组织中SOD、p-Akt和Nrf 2的表达(P<0.05);降低肠组织的病理学损伤和细胞凋亡、细胞及肠组织中MDA、ROS和PTEN的表达(P<0.05)。与NC mimic-Exo相比,mi R-144-3p mimic-exo的调节作用更强(P<0.05)。mi R-144 inhibitor-Exo的应用部分逆转了NC mimic-Exo的调节作用(P<0.05)。结论1.本研究成功从小鼠骨髓中分离得到了BMSCs;2.本研究成功提取得到了BMSC-exo;3.BMSCs通过其分泌的外泌体改善肠I/R损伤;4.BMSC-exo减轻肠I/R损伤的作用与mi R-144-3p有关,BMSC-exo通过mi R-144-3p调节PTEN/Akt/Nrf2信号通路介导的氧化应激,从而改善肠I/R损伤。