细胞凋亡是当今生命科学研究的热点,科学技术的进步与发展为细胞凋亡的研究提供了有力武器。比如无细胞体系,在细胞凋亡的应用中有不可取代的优越性。无细胞体系最初主要应用于细胞重大生命活动的机理研究.。例如在亚细胞水平和分子水平上研究细胞核的体外重建、细胞周期的调控等。1993年,lazebnik等科学家首次将其应用于细胞凋亡的研究。无细胞体系在哺乳动物细胞和植物细胞凋亡的应用中已经取得了很多成果,但在昆虫细胞凋亡的应用中还正在深入。本文应用无细胞体系对昆虫细胞凋亡的有关方面进行了探讨和研究。我们以前的研究结果已证明,杆状病毒中的芹菜夜蛾核型多角体病毒SfMNPV和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV诱导的斜纹夜蛾(Spodoptera litura)Sl-1细胞凋亡过程中,细胞色素C(cytc)从线粒体释放至胞质是细胞凋亡的关键步骤。本实验以Sl-1细胞核为研究对象,用Sl-1细胞浆制备的无细胞体系作为反应体系。在无细胞体系中以纯化的外源cytc作为诱导剂,诱导Sl-l细胞核发生凋亡,研究了Sl-1胞核凋亡的特征,进一步探究了cytc在昆虫细胞凋亡中的作用。主要工作包括以下几个方面:(1)外源cytc对Sl-1细胞核的影响细胞凋亡形态学判断是凋亡检测的经典标准,最为常用及最为简便的方法是使用荧光显微镜观察细胞核的凋亡过程。本实验采用DAPI染料,直接对细胞核进行染色,用荧光显微镜观察细胞核的形态变化。由于凋亡相关的特异核酸酶对细胞核染色质DNA进行特异切割,经琼脂糖凝胶电泳可见典型的梯形图谱。这是细胞凋亡一个强有力的生化指标。本实验提取凋亡细胞核DNA进行凝胶电泳,检测其DNA变化。通过上述两种方法研究了细胞色素C诱导Sl-1细胞核发生凋亡的作用。结果表明,一定浓度的外源cytc将无细胞体系激活为凋亡体系,细胞核在凋亡体系中,置28℃培养箱,分别孵育2hr,4hr,6hr,8hr。DAPI染色结果显示细胞核固缩并逐渐变形,核内染色质凝集并趋边化,有空泡形成。随着孵育时间的延长细胞核直至破裂成大量的小块而被核膜包裹,类似于凋亡体。细胞核孵育12 hr之后,荧光显微镜下几乎看不到完整的细胞核,整个视野中充满高亮度的细小的荧光球。这说明cytc可诱导Sl-1细胞核发生凋亡。提取凋亡细胞核DNA经琼脂糖凝胶电泳呈现典型的凋亡细胞DNA梯形电泳谱带,且细胞核孵育时间越长,电泳梯形条带越明显。结果进一步证实了cyte可诱导Sl-1细胞核发生凋亡。(2) cytc对caspase-3活性的影响检测细胞凋亡的另外一个重要生化指标是检测胱天蛋白酶的活性。如caspase-3,caspase-8,caspase-9等在细胞凋亡过程中被激活,由无活性的酶原成为有活性的酶。活化的caspase对其底物具有特异性切割性,通过这一特性来检验相应的胱天蛋白酶的活性。本实验应用荧光定量技术检测cytc诱导Sl-1细胞核发生凋亡过程中caspase-3的活性变化。分别在孵育不同时间的凋亡体系中加入等量的caspase-3的特异性底物Asp-Glu-Val-Asp(DVED),根据底物被剪切的程度,用荧光定量法检测caspase-3的活性。实验结果表明,cytc诱导Sl-1细胞核发生凋亡过程中,caspase-3被激活,且其活性随着孵育时间的延长而增强。