新孢子虫是一种专性细胞内寄生的顶复门原虫,其感染造成的新孢子虫病能够引起孕畜流产,或幼畜出现运动神经系统障碍,给养殖业带来巨大的经济损失,以养牛业最为严重。截至目前,尚无有效的商用防治疫苗。新孢子虫感染及致病机制比较复杂,在宿主免疫反应作用下,新孢子虫速殖子转换为缓慢生长、几乎处于休眠状态的缓殖子,并形成组织包囊,逃避宿主免疫系统的攻击。目前,宿主与新孢子虫间的相互关系仍然未被研究透彻。细胞自噬是用于维持细胞内环境稳定的高度保守机制,在机体多种生理过程中发挥重要作用。目前,新孢子虫感染与宿主细胞自噬是否相互影响未见报道。本文主要对新孢子虫及细胞自噬开展了以下几方面的研究:1.新孢子虫诱导小鼠巨噬细胞自噬的检测建立新孢子虫感染小鼠腹腔巨噬细胞模型,结合多种手段检测宿主细胞自噬状态:通过透射电镜检测自噬小体的形成,利用激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3的聚集,采用荧光定量PCR和Western blot检测自噬相关蛋白的表达情况。研究结果发现,在新孢子虫感染早期的巨噬细胞中可观察到大量自噬体样结构,且自噬相关蛋白上调表达,初步表明新孢子虫感染激活了宿主细胞自噬初始阶段。进一步检测了自噬流的状态,通过激光共聚焦显微镜观察发现,新孢子虫感染引起LC3聚集,与细胞自噬激动剂雷帕霉素处理组结果一致,说明新孢子虫感染诱导激活细胞自噬。另外,通过Western blot分析发现,新孢子虫感染2 h后LC3-I向LC3-II的转化率最高。并且当自噬溶酶体的结合被抑制,新孢子虫诱导的LC3-II蛋白量显著增多,表明新孢子虫在感染早期能够激活小鼠巨噬细胞自噬早期阶段;随着感染时间的延长,与对照组相比,自噬溶酶体降解的标志物p62表达量上调,并且新孢子虫分别感染雷帕霉素和Baf A处理的巨噬细胞8 h后,检测到细胞内p62蛋白均上调表达,表明新孢子虫感染抑制了自噬溶酶体形成,影响了p62的降解;溶酶体标记物LAMP1随新孢子虫感染时间延长表达量增高,但是通过细胞免疫荧光试验检测感染8 h时,LC3与LAMP1共定位减少,表明新孢子虫感染过程中抑制了自噬体与溶酶体的结合,抑制了自噬流,形成不完全细胞自噬。研究检测了细胞自噬负调控AKT/m TOR通路激活情况,发现AKT/m TOR信号通路在新孢子虫感染过程中被激活,说明新孢子虫通过非m TOR依赖途径诱导了小鼠巨噬细胞的不完全细胞自噬。2.TLR2在新孢子虫诱导小鼠巨噬细胞自噬中的调节作用为进一步探究TLRs在新孢子虫感染以及调控细胞自噬中的作用机制,通过荧光定量PCR、PCR Arrays、细胞免疫荧光试验和动物试验等多种手段检测新孢子虫感染后TLRs及自噬相关通路的激活情况。结果表明,新孢子虫感染能够激活巨噬细胞包括NF-κB在内的多种通路,诱导多种TLRs上调表达,其中TLR2是主要被激活的受体之一,确定为后续的研究对象。新孢子虫感染巨噬细胞后NF-κB p65蛋白磷酸化程度升高,且向细胞核转移显著增多;但在TLR2-/-感染组中p65磷酸化水平降低,核转移情况基本消失。ELISA检测结果表明TLR2-/-感染组中IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-6的分泌显著减少。说明新孢子虫感染通过TLR2激活NF-κB信号通路,调控多种细胞因子分泌。进一步探讨TLR2是否参与新孢子虫感染引发的宿主细胞不完全自噬,结合Western blot、免疫荧光对LC3、p62的表达及聚集状态进行分析。结果表明,TLR2缺失不影响自噬小体的形成,但p62在细胞质内的积累情况有所缓解,推测TLR2可能参与了新孢子虫诱导的自噬小体与溶酶体结合的抑制作用。另外,TLR2缺失后,AKT/m TOR的磷酸化程度降低,说明TLR2参与激活AKT/m TOR信号通路。通过生存实验及病理分析,进一步研究了TLR2是否在机体抵抗新孢子虫感染的过程中发挥作用,结果发现新孢子虫感染后TLR2-/-小鼠主要脏器受损程度更加严重,存活率降低,说明TLR2参与介导了机体抗新孢子虫感染的反应。3.新孢子虫对牛巨噬细胞细胞自噬及TLR2表达的影响牛是新孢子虫的天然宿主,为确定牛细胞自噬及TLRs在新孢子虫感染过程中的作用,以牛巨噬细胞为模型进行研究。构建新孢子虫感染牛外周血单核/巨噬细胞及牛腹腔巨噬细胞细胞模型,通过荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光及ELISA检测,发现牛巨噬细胞TLR2/NF-κB信号通路被激活,炎性因子大量分泌。另外,研究发现,新孢子虫感染牛巨噬细胞后细胞自噬的激活起始时间较小鼠巨噬细胞延迟发生,感染后24 h时LC3-II表达量显著增高。新孢子虫在牛巨噬细胞中引起的自噬流不畅通,形成不完全自噬,结果与小鼠试验相似,并且牛巨噬细胞自噬的激活与新孢子虫虫体活力无关。4.细胞自噬在新孢子虫感染中的作用通过自噬诱导剂和抑制剂调控自噬,并结合si RNA检测细胞自噬对新孢子虫感染的影响。结果表明,自噬诱导剂雷帕霉素激活细胞自噬后促进新孢子虫的入侵及增殖;自噬抑制剂3-MA降低自噬小体的形成,降低了新孢子虫的入侵及增殖。通过si ATG5作用干扰了自噬小体的形成,结果发现新孢子虫的入侵和增殖均显著降低。另外,ELISA结果表明,抑制细胞自噬显著降低了新孢子虫感染诱导细胞因子的分泌量。通过小鼠动物试验探讨细胞自噬对新孢子虫感染的影响。结果表明,与新孢子虫感染组相比,诱导剂雷帕霉素处理的新孢子虫感染组中,小鼠感染初始位置免疫细胞中新孢子虫感染率及虫体增殖量显著增高,小鼠存活率显著降低;而抑制剂3-MA处理的新孢子虫感染小鼠,存活率与新孢子虫感染组没有显著差异,但在感染初始位置的免疫细胞中虫体感染率及增殖量得到了控制。综上所述,本研究发现新孢子虫刺激的巨噬细胞通过非m TOR依赖途径诱导不完全自噬,形成大量自噬小体。TLR2参与新孢子虫感染诱导的炎症反应,并参与调控巨噬细胞不完全自噬。另外,激活细胞自噬促进了新孢子虫感染,抑制自噬小体的形成有助于控制新孢子虫感染。本研究为进一步揭示宿主与新孢子虫相互作用关系提供新的补充,提示调控宿主细胞自噬可以作为防治新孢子虫感染的新策略。