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目的:探讨序列相似性家族134成员B(FAM134B)介导的内质网自噬(ER-phagy)在二硫苏糖醇(DTT)诱导BRL-3A大鼠正常肝细胞发生肝细胞凋亡中的作用及机制。方法:(1)分别以不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mmol/L)的DTT处理BRL-3A细胞24 h,或者以2.0 mmol/L DTT处理BRL-3A细胞不同时间(0、3、6、12、24 h),建立体外肝细胞内质网应激(ERS)细胞模型。采用Western blot检测各组细胞中ERS及ER-phagy相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、钙联蛋白(CNX)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、FAM134B、微管相关蛋白轻链3(LC3)、自噬相关蛋白12(Atg12)在蛋白水平的表达变化;采用流式细胞术检测DTT对各组细胞周期及细胞凋亡的影响。采用0、2.0mmol/L DTT作用于BRL-3A细胞24 h后,应用免疫共沉淀(Co-IP)检测FAM134B、CNX与LC3之间的相互作用;利用免疫荧光技术通过激光共聚焦显微镜观察内质网标志蛋白CNX与溶酶体标志蛋白LAMP2的共定位;利用内质网荧光探针ER-Tracker Red和溶酶体荧光探针Lyso-Tracker Green通过激光共聚焦显微镜观察内质网与溶酶体的共定位,以此反应ER-phagy过程中包裹内质网片段的自噬溶酶体形成情况。(2)分别以不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mmol/L)的DTT处理BRL-3A细胞24 h,或者以2.0 mmol/L DTT处理BRL-3A细胞不同时间(0、3、6、12、24 h)后,采用Western blot检测各组细胞中线粒体-内质网接触位点(MERCs)相关蛋白,包括内质网钙离子释放通道1,4,5-三磷酸肌醇1型受体(IP3R1)、葡萄糖调节蛋白75(GRP75)、电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)及线粒体凋亡途径相关蛋白,包括活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、细胞色素c(Cyt C)表达水平的变化。采用0、2.0 mmol/L DTT作用于BRL-3A细胞24 h后,利用内质网荧光探针ER-Tracker Red、线粒体荧光探针Mito-Tracker Green以及钙离子荧光探针Rhod 2-AM通过激光共聚焦显微镜观察线粒体-内质网偶联变化以及线粒体内Ca2+浓度变化;采用JC-1染色检测线粒体膜电位的变化。(3)采用FAM134B si RNA转染BRL-3A细胞,观察将FAM134B基因沉默后其对DTT诱导的肝细胞凋亡的影响,并采用Western blot检测Cleaved Caspase-3以及Cyt C表达水平的变化;采用流式细胞术检测细胞周期与凋亡的变化;采用JC-1染色法检测线粒体膜电位的变化。结果:(1)Western blot结果显示,DTT可显著上调细胞内GRP78、CNX、CHOP、FAM134B、LC3、Atg12等蛋白的表达水平(P<0.05);流式细胞术检测发现,DTT处理细胞后细胞凋亡逐渐增加,且细胞周期被阻滞于G0/G1期(P<0.05)。蛋白质免疫共沉淀检测证实,FAM134B、CNX、LC3之间存在相互作用;激光共聚焦显微镜观察发现,2.0 mmol/L DTT处理细胞后CNX与LAMP2的表达共定位及内质网与溶酶体的共定位区域均显著减少。(2)Western blot结果显示,DTT可显著上调细胞内IP3R1、GRP75、VDAC1、Cleaved Caspase-3、Cyt C等蛋白的表达水平(P<0.05);此外,激光共聚焦显微镜观察发现,2.0 mmol/L DTT处理后细胞内线粒体与内质网的共定位区域以及线粒体内Ca2+水平均显著增加;JC-1染色法检测发现,2.0 mmol/L DTT处理组线粒体膜电位水平较对照组显著降低(P<0.05)。(3)采用小干扰RNA技术沉默BRL-3A细胞中的FAM134B基因,再加入2.0 mmol/L DTT处理FAM134B基因沉默的细胞24 h后,Cleaved Caspase-3以及Cyt C蛋白的表达增加(P<0.05);此外,流式细胞术检测发现,沉默FAM134B可导致细胞内线粒体膜电位水平进一步下降(P<0.05),并促进DTT诱导的肝细胞凋亡及阻碍细胞周期的进程(P<0.05)。结论:1.FAM134B介导的内质网自噬可能在恢复内质网稳态中发挥保护作用,从而减轻内质网应激诱导的肝细胞凋亡,并且敲低FAM134B可促进DTT诱导的肝细胞凋亡。2.在持续的内质网应激过程中,由于包含内质网片段的自噬溶酶体的形成减少,使内质网自噬过程被阻断,促进内质网与线粒体的Ca2+传递,从而诱导肝细胞发生线粒体相关途径的凋亡。同时,敲低FAM134B可加重DTT导致的线粒体膜电位的降低,促进线粒体途径诱导的细胞凋亡的发生。