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目的:随着交通事业及工农业的发展,周围神经损伤是临床上常见的致残性疾病,而周围神经损伤的治疗一直是临床上棘手的问题,目前基因治疗的研究已经成为周围损伤研究领域的前沿课题和热点。其中腺病毒载体(Adenovirus,AdV)在介导基因转染方面已表现出多方面的优势,使得AdV成为神经再生、神经示踪研究及神经肌肉疾病基因治疗的实验研究中最具魅力的载体之一。将一些外源性的基因通过AdV导入神经系统内,通过导入的外源性基因在神经系统内的表达来发挥作用,促进周围神经的再生,其中最主要的问题是外源性基因在脊髓及周围神经细胞中的表达情况。本实验将将携带LacZ基因的AdV (AdLacZ)与不带外源基因的Ad0或与携带有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4immunoglobulin,CTLA4Ig )基因的AdV (AdCTLA4Ig)通过微量注射导入大鼠腰膨大脊髓实质内,比较共同转染AdCTLA4Ig后β-gal在脊髓表达水平变化;通过多聚酶链反应(PCR)监测腺病毒注入后在脊髓的消失时间和采用病毒液10倍系列稀释提取DNA检测出腺病毒的特异性条带的最低稀释度及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测比较CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表达,并用流式细胞仪来测定血中淋巴细胞亚群的变化,以探讨CTLA4Ig诱导机体对AdLacZ的免疫耐受的作用及其机理,观察腺病毒在脊髓表达的影响因素。方法:选用7周龄健康雌性Wister大鼠200只,体重200～250g。将大鼠随机分成两组,每组100只。对照组(A组)导入AdlacZ+Ad0 ,实验组( B组)导入AdlacZ+AdCTLA4Ig。将大鼠经腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约2cm后正中切口,去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-III型手动推进器,于脊髓后正中动脉右侧0.8mm处注射AdlacZ (1×109pfu/ml)和Ad0(5×109pfu/ml)各1μl(A组)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109 pfu/ml)各1μl(B组)。针尖向头侧呈45度斜行进针,斜行刺入深度为2.5mm。注射速度为1μl/min,注射完毕后滞针5min,缓慢拔针。充分止血、冲洗伤口,局部喷洒抗生素预防感染,关闭伤口。两组在转染病毒后10个不同的时间点鼠尾静脉取血2ml;在转染后10个不同时间点,对两组动物脊髓进行厚50μm的连续冰冻横切片,计数A组与B组中X-gal染色阳性的切片数,分析比较两组LacZ基因在脊髓表达的高峰期和持续时间;多聚酶链反应(PCR)监测腺病毒注入后在脊髓的消失时间采用病毒液10倍系列稀释提取DNA检测出腺病毒的灵敏度及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表达,并用流式细胞仪来测定血中淋巴细胞亚群CD4和CD8的变化。结果:1 X-gal, CTLA4Ig转基因表达:LacZ基因和CTLA4Ig基因转染脊髓双侧的前角运动细胞和周围的胶质细胞。转基因表达范围局限于注射点上下各0.6cm区段,有转基因表达的阳性冰冻横切片数≤240片。转基因神经元在注射同侧表达较对侧强烈。切片观察可见A组的X-gal染色阳性表达时间约为2周;而B组的X-gal染色阳性表达时间约为4周。脊髓阳性切片计数显示两组β-gal在脊髓表达的高峰期均在2～8天,统计学分析表明两组之间在高峰期间阳性切片数无显著差异(P>0.05)。2 PCR检测2.1腺病毒液PCR检测:腺病毒的表达量随着浓度的降低而逐渐减小。采用病毒液10倍系列稀释提取后DNA经PCR反应可检测出腺病毒的特异性条带的最低稀释度为10-4。AdlacZ(1×109pfu/ml)与Ad0(5×109 pfu/ml)特异性条带的最低稀释度一致。2.2脊髓标本腺病毒PCR检测:用PCR法从DNA水平分别检测腺病毒在对照组、实验组的表达情况,腺病毒的DNA量是随时间延长逐渐下降的,直至第10周检测不到腺病毒的表达。3 RT-PCR检测:转染后均可见β-gal和CTLA4IgmRNA的表达。B组β-gal表达时间长于A组。统计学分析表明两组之间β-gal表达量无显著差异(P>0.05)。3.1β-galmRNA在大鼠脊髓组织的表达:用RT-PCR法从mRNA水平分别检测β-gal在对照组、实验组的表达情况:转染1天后两组均可检测出β-galmRNA在大鼠脊髓组织的表达,对照组实验组表达上调高峰均为术后3天,高表达量可以持续到3周,对照组到第8周完全消失。实验组到第9周完全消失。统计学分析表明两组之间在高峰期间细胞表达数无显著差异(P>0.05),组内不同时间点比较细胞表达数有显著差异(P<0.05)。3.2 CTLA4IgmRNA在大鼠脊髓组织的表达:用RT-PCR法从mRNA水平分别检测CTLA4IgmRNA在实验组的表达情况。转染一天后实验组可检测出CTLA4IgmRNA在大鼠脊髓组织的表达,表达上调高峰为术后3-5天,高表达量可以持续到3周,到第9周完全消失。4流式细胞学检测:流式细胞仪分析显示,两组转染后1天血中CD4、CD8淋巴细胞开始升高,2天CD8淋巴细胞显著升高,而CD4淋巴细胞则在转染后第6天开始显著升高,两种细胞直至9天左右达到高峰,两周后CD4淋巴细胞保持在一个稳定的水平,CD8淋巴细胞随着时间数量逐渐减少。实验组CD4、CD8淋巴细胞数值均小于对照组,统计学分析表明两组之间在高峰期间细胞表达数无显著差异(P>0.05),组内不同时间点比较细胞表达数有显著差异(P<0.05)。结论:将AdV介导的CTLA4Ig基因注射入脊髓能有效地抑制局部T淋巴细胞的浸润,从而减轻由AdV介导的局部炎症反应,抑制机体对病毒载体的排斥反应,显著延长共同导入LacZ基因在脊髓的表达,但不影响基因表达强度。AdCTLA4Ig对体液免疫应答的抑制作用不明显。从而得出结论,时间、免疫反应、腺病毒的浓度都是影响腺病毒携带基因在脊髓表达的影响因素。