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目的:分析中间丝相关蛋白基因(FLG)突变对特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)中间丝相关蛋白表达的影响及与疾病表型的关系。同时研究金黄色葡萄球菌超抗原对人角质形成细胞中间丝相关蛋白表达的影响。
方法:对25例AD患者及23例无AD史、其他特应性疾病史的健康对照者进行FLG全基因测序,通过real-time RT-PCR及免疫组化方法检测AD患者皮损组织及健康对照皮肤组织中间丝相关蛋白表达。采用CCK-8法检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)对人角质形成细胞株HaCaT细胞增殖的影响。采用real-time RT-PCR、Western Blot及免疫荧光染色检测SEB对不同分化状态下的HaCaT细胞中间丝相关蛋白表达的影响。
结果:25例AD患者(男性20例,女性4例,平均年龄6.90±7.81岁)中共有5例检测到FLG突变。突变类型为4种,分别为位于重复序列2的3321delA的杂合子2例,位于重复序列6的6834del5杂合子1例和6950del8纯合子1例,以及位于重复序列7的Q2417X杂合子1例。而在23例健康对照者中均未检测到突变。AD患者发病年龄FLG突变型低于野生型,但无显著差异(突变型VS野生型,0.21±0.14岁VS 1.63±4.16岁,P>0.05)。FLG突变与疾病严重度SCORAD评分无关(突变型VS野生型,59.4±15.9 VS 64.7±12.8,P>0.05)。5例FLG突变型患者均有掌纹增多征,与野生型相比有显著差异(χ2=11.111,P<0.01)。采用real-time RT-PCR法定量比较AD患者皮损及健康对照皮肤组织FLG表达水平,结果显示6950del8纯合子患者FLG表达明显缺陷,2例3321delA杂合子患者FLG mRNA水平明显下降,而6834del5杂合子及Q2417X杂合子FLG表达水平较野生型升高或接近。AD患者FLG突变型及野生型皮损中FLG mRNA水平均较健康对照显著下降(P<0.001),而两者间相比无显著差异。此外,AD患者FLG mRNA表达量与SCORAD评分无相关性。免疫组化染色显示AD患者角质层中间丝相关蛋白染色普遍缺失,颗粒层弱表达中间丝相关蛋白。使用光密度平均值代表免疫组化染色强度进行统计后发现,FLG突变型及野生型中间丝相关蛋白染色强度均较健康对照下降(P<0.001),FLG突变型中间丝相关蛋白染色强度较野生型下降(P<0.05)。AD患者FLG mRNA表达水平与中间丝相关蛋白免疫组化染色强度呈中度正相关(r=0.70,Spearman 相关分析,P<0.05)。CCK-8法检测结果显示,各浓度SEB组(0.05, 0.1,0.2, 0.5, 1.0μg /mL)均对HaCaT细胞增殖活力无明显影响(P>0.05),SEB对HaCaT细胞未显示出细胞毒性。在常规培养条件下(Ca2+1.6mmol/L),各浓度组SEB作用HaCaT细胞48小时后,对FLG mRNA水平无明显影响(P>0.05)。而高钙(Ca2+10mmol/L)培养环境能诱导HaCaT细胞FLG高表达,其FLG mRNA水平是常规培养环境下的4.98倍(P<0.001),免疫荧光染色显示细胞呈现终末分化状态,胞浆中间丝相关蛋白浓聚集。而高钙环境下SEB或Th2型细胞因子作用48小时后HaCaT细胞中间丝相关蛋白表达明显减少。SEB浓度达到0.1μg/mL时即可造成分化中的HaCaT细胞FLG表达水平显著下降(P<0.01),并且与Th2型细胞因子(IL-4/13:50ng/ml)下调HaCaT细胞FLG mRNA水平相近。Western Blot检测结果显示,高钙培养环境下SEB或Th2型细胞因子刺激后的HaCaT细胞中间丝相关蛋白表达均明显下降。本研究还检测了SEB及Th2型细胞因子对HaCaT细胞分泌的抗菌肽人β-防御素3(HBD-3)表达的影响。高钙培养环境下SEB及Th2型细胞因子均能下调HaCaT细胞HBD-3mRNA水平(P值分别<0.05及<0.01)。
结论:在AD患者中,FLG突变型患者皮损中间丝相关蛋白表达水平较野生型下降。对于 FLG杂合突变,突变位置距离重复序列起始位置越近,AD患者皮损中间丝相关蛋白单倍体不足表现越明显。AD患者皮损中间丝相关蛋白表达水平普遍较健康对照下降,这一结果提示除了遗传因素,造成中间丝相关蛋白表达缺陷可以是后天获得性的。此外,掌纹增多征可以做为FLG突变的一个重要临床体征。金黄色葡萄球菌超抗原SEB对HaCaT细胞增殖无影响。SEB对分化过程中的HaCaT细胞中间丝相关蛋白及抗菌肽HBD-3表达起着负调节作用。我们的研究表明SEB也是造成AD中间丝相关蛋白表达下调的环节,并且能抑制表皮抗细菌感染功能。