论文部分内容阅读
目的:探究金丝桃苷（Hyperoside,Hyp）通过瞬时受体电位阳离子通道蛋白6（Transient receptor potential canonical 6,TRPC6）通道对不同时间段大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）的影响。方法:1.采用网络药理学方法,通过TCMSP、Swiss Target Prediction、Pharm Mapper、Similarity ensemble approach、Online Mendelian Inheritance in Man、Dis GENT等数据库获取Hyp和缺血再灌注损伤的作用靶点。分别利用Omishare和STRING数据库筛选出药物和疾病的共同靶点,构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络图,再应用Cytoscape软件构建Hyp和疾病靶点间的相互作用网络并进行拓扑交联分析。采用David数据库对核心靶点进行基因本体（Gene Ontology,GO）分析,再利用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）数据库对核心靶点进行相关通路分析。2.细胞实验:体外培养PC12细胞并将其分为7组,正常组（Normal）、模型组（Model）、Hyp组（100μmol/L）、Hyp+TRPC6通道抑制剂SAR7334组（100μmol/L+1μmol/L）、SAR7334组（1μmol/L）、Hyp+TRPC6通道激动剂OAG组（100μmol/L+100μmol/L）、OAG组（100μmol/L）。CCK-8检测PC12细胞在Hyp不同浓度下的生存活力;BX-41型倒置显微镜观察细胞生长状态;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;激光共聚焦显微镜拍摄不同组别PC12细胞内Ca2+浓度。3.动物实验:将雄性SD大鼠随机分为15组,分别是假手术组（Sham,1 d、3 d、7 d）、MCAO组（1 d、3 d、7 d）、Hyp组（1 d、3 d、7d）、Hyp+TRPC6通道抑制剂SAR7334组（1 d、3 d、7d）、SAR7334组（1 d、3 d、7 d）,每组各10只。除Sham组,其余各组运用大脑中动脉闭塞（Middlecerebral artery occlusion,MCAO）构建局灶性脑缺血再灌注损伤模型。Hyp（50 mg/kg）采用术后尾静脉注射给药,TRPC6通道抑制剂SAR7334（10 mg/kg）采用术后腹腔注射,其余组大鼠尾静脉注射生理盐水（Normal saline,NS）。激光散斑血流成像观察大鼠脑部血流量;改良Longa评分对各组动物进行行为学评定;TTC染色检测大鼠脑组织梗死情况;HE染色检测大鼠缺血脑组织病理变化;Western blot和RT-q PCR分别检测各组大鼠脑组织TRPC6、脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CAMP-response element binding protein,CREB）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cysteinyl aspartate specificproteinase 3,Caspase-3）、切割型Caspase-3（cleaved Caspase-3）蛋白及mRNA表达水平;免疫组化检测TRPC6蛋白的表达水平;Nissl染色观察Nissl小体的状态;免疫荧光检测大鼠脑神经元的生长状态。结果:1.通过相关数据库共得到327个Hyp相关作用靶点以及472个缺血再灌注相关靶点,筛选出44个Hyp和缺血再灌注共同基因靶点。分析后共得到54条GO富集信号通路,43条KEGG富集信号通路,表明Hyp抗缺血再灌注损伤作用机制可能与PI3K-Akt、RAP1、RAS、VEGF等信号传导通路相关。2.细胞实验:（1）CCK-8结果显示Hyp浓度达到40μg/m L时细胞的存活率显著上升（P＜0.05）。经过葡萄糖剥夺/再灌注（Oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）损伤处理后Hyp浓度达到50μg/m L时细胞的存活率最高。（2）流式结果显示,同Normal组比较,Model组PC12细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）。与Model组相比,Hyp组PC12细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）。与Hyp组比较,Hyp+SAR7334组PC12细胞凋亡率显著增加（P＜0.01）;与SAR7334组比较,Hyp+SAR7334组细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）;与Hyp组或OAG组相比,Hyp+OAG组细胞凋亡率显著下降（P＜0.01）。（3）激光共聚焦显微镜拍摄结果分析显示,与Model组相比,Hyp组PC12细胞Ca2+平均荧光强度显著降低（P＜0.01）。与Hyp组比较,Hyp+SAR7334组PC12细胞内Ca2+平均荧光强度略有增强（P＞0.05）;与SAR7334组比较,Hyp+SAR7334组细胞荧光强度显著降低（P＜0.01）;与Hyp组或OAG组相比,Hyp+OAG组细胞荧光强度略有降低（P＞0.05）。3.动物实验:（1）激光散斑血流成像显示MCAO组右侧脑部血流量比左侧少,说明右侧脑室缺血模型成功。术后12 h可见右侧脑部血流量比左侧少,但缺血较2 h得到一定改善。（2）行为学评分结果显示,Hyp可显著降低同时段MCAO大鼠的神经功能评分（P＜0.01）;与Hyp组比较,Hyp+SAR7334组1 d、3 d时大鼠神经功能评分显著升高（P＜0.05）,7 d时Hyp+SAR7334组评分略有升高（P＞0.05）。与SAR7334组比较,Hyp+SAR7334组细胞大鼠神经功能评分降低（P＞0.05）。（3）TTC染色显示,使用Hyp后大鼠脑组织梗死灶相较于同时段MCAO组显著减小（P＜0.01）;与Hyp组比较,Hyp+SAR7334组大鼠右侧脑组织梗死面积略有增加（P＞0.05）;与SAR7334组比较,Hyp+SAR7334组脑梗死率显著减少（P＜0.05,P＜0.01）。（4）HE染色结果显示,使用Hyp后大鼠脑组织可见空泡和坏死的细胞减少,细胞形态相对于同时段MCAO组更规则。而相较于同时段Hyp组,Hyp+SAR7334组脑损伤进一步加重;与同时段SAR7334组比较,Hyp+SAR7334组右侧脑损伤得到明显改善。（5）Western blot结果显示,与Sham组相比,同时段MCAO大鼠脑组织中TRPC6、CREB、BDNF蛋白表达水平显著下调（P＜0.01）,Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表达显著上调（P＜0.01）。与同时段MCAO组相比,Hyp组大鼠脑组织中TRPC6、CREB、BDNF蛋白表达显著上调（P＜0.01,P＜0.05）,Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表达下调（P＜0.01,P＜0.05）,而7 d Hyp组BDNF蛋白表达略有上调（P＞0.05）。与同时段Hyp组相比,1 d Hyp+SAR7334组BDNF、CREB蛋白表达显著下调（P＜0.01）,3 d Hyp+SAR7334组cleaved Caspase-3蛋白表达显著上调（P＜0.05）,其余时间段Hyp+SAR7334组TRPC6、CREB、BDNF蛋白表达略有下调（P＞0.05）,Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表达略有上调（P＞0.05）;与同时段SAR7334组相比,1 d Hyp+SAR7334组TRPC6、CREB、BDNF蛋白表达显著升高（P＜0.01,P＜0.05）,3 d、7 d Hyp+SAR7334组TRPC6、CREB蛋白表达略有上调（P＞0.05）,Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表达显著下调（P＜0.01,P＜0.05）;3 d Hyp+SAR7334组BDNF蛋白表达显著上调（P＜0.01,P＜0.05）,7 dHyp+SAR7334组BDNF蛋白表达略有上调（P＞0.05）。（6）RT-q PCR结果显示,与Sham组相比,同时段MCAO大鼠脑组织中TRPC6、CREB、BDNF mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）,Caspase-3 mRNA表达显著增加（P＜0.01）。与同时段MCAO组相比,Hyp组大鼠脑组织中TRPC6、CREB、BDNF mRNA表达显著增加（P＜0.01）,Caspase-3 mRNA表达显著降低（P＜0.01）。与同时段Hyp组相比,Hyp+SAR7334组TRPC6、CREB、BDNF mRNA表达显著降低（P＜0.01）,Caspase-3 mRNA表达显著增加（P＜0.01,P＜0.05）。与同时段SAR7334组相比,Hyp+SAR7334组TRPC6、CREB、BDNF mRNA表达显著增加（P＜0.01）,Caspase-3 mRNA表达显著降低（P＜0.01）。（7）免疫组织化学结果显示,用药Hyp后大鼠脑部空泡减少,棕褐色阳性细胞明显增多。相较于Hyp组,同时间段Hyp+SAR7334组脑组织中棕褐色阳性细胞明显减少;与同时间段SAR7334组相比,Hyp+SAR7334阳性细胞明显增多。（8）Nissl染色显示,与MCAO组相比同时段Hyp组大鼠尼氏小体形态得到明显改善,尼氏小体数量相对增加。相较于Hyp组,同时段Hyp+SAR7334组尼氏小体数量明显减少;与同时段SAR7334组相比,Hyp+SAR7334组尼氏小体数量明显增加。（9）免疫荧光结果显示,与同时段MCAO组相比,Hyp组可见少量阳性细胞表达,视野中着色神经元的数量相对增加。相较于Hyp组,同时段Hyp+SAR7334组大鼠着色神经元的数量显著减少;与SAR7334组相比,同时段Hyp+SAR7334组着色神经元的数量显著增加。结论:Hyp可以改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤,其机制可能与其激活TRPC6通路,降低缺血区梗死面积,改善脑神经元的生存状态,上调TRPC6、BDNF、CREB相关活性信号分子表达,降低细胞内Ca2+超载,减少细胞凋亡,从而改善脑缺血再灌注损伤。