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第一部分口腔癌组织中miR-30a-5p及FAP的表达及其相互关系的研究目的:分析口腔癌组织中miR-30a-5p及FAP的表达及其相互关系。方法:从口腔癌手术切除标本中获得66个口腔癌组织和25个相邻的正常组织(离肿瘤边缘至少2-3cm,术后病理检查证实没有肿瘤),纳入标准同Fu等的研究:即患者被诊断患有口腔癌,但之前没有接受过放疗和化疗,取得患者书面同意。于2014年-2015年在武汉大学人民医院及武汉大学口腔医院收集了上述两组标本。所有临床标本在切除后立即收集,并保存在液氮中直至RNA提取。本研究经武汉大学人民医院及武汉大学口腔医院批准,所有参与者签署了知情同意书。标本获取后,进行细胞培养、细胞转染、RNA提取以及RT-qPCR,通过Western印迹分析,双荧光素酶报告基因测定和生物素偶联的miRNApull-down实验(蛋白质体外结合实验)验证miR-30a-5p与FAP之间的目标关系。结果:癌组织中的miR-30a-5p表达是邻近组织的0.35倍,而癌组织中的FAP mRNA表达是邻近组织的3.3倍(P<0.05)。此外,miR-30a-5p和FAP在邻近组织和OSCC细胞中呈负相关(P<0.05)。Western印迹证实FAP在癌组织中高表达。此外,与正常细胞系NHOEC相比,不同OSCC细胞系Tca-8113,SCC-4,SCC-15,SCC-25中的FAP也高表达。我们进一步检测了不同细胞系中miR-30a-5p的RNA表达,其中Tca-8113和SCC-15细胞显示最低表达。并且Tca-8113和SCC-15细胞中不同细胞系中FAP的mRNA水平最高上调。Targetscan(http://www.targetscan.org/)预测了 miR-30a-5p 和 FAP 3’-UTR 的靶向位点,并将用作载体的 HEK-293T 细胞与 pGL-3FAP-WT,pGL-3FAP-MUT,miR-30a-5p模拟物和模拟控制组共同转染。pGL-3-FAP-WT组的相对荧光素酶活性显着低于pGL-3-FAP-MUT组,这表明miR-30a-5p与FAP之间存在直接的靶向关系(P<0.01)。另外,用生物素化的miR-30a-5p(Bi-miR-30a-5p)和生物素化的非特异性miRNA(Bi-NC)瞬时转染在FAP cDNA,转染后稳定表达FAP的HEK-293T细胞。FAPmRNA水平的RT-qPCR分析显示FAPmRNA比bi-NC组(标准化为1)高3.5倍(P<0.05),进一步验证了目标关系。将细胞分成8组:对照(未处理),NC(LipofectamineTM2000 处理),模拟物(miR-30a-5p 模拟物),抑制剂(miR-30a-5p 抑制剂),FAP(pcDNA3.1-FAP),siFAPFAPsiRNA),模拟物 + siFAP(miR-30a-5p模拟物和FAP siRNA)和模拟物+ FAP(miR-30a-5p模拟物和pcDNA3.1-FAP),每组与对照(归一化为1)进行比较。转染后48h,miR-30a-5p模拟物组,miR-30a-5p 模拟物 + siFAP 组和 miR-30a-5p 模拟物 + FAP 组 miR-30a-5p mRNA表达显著增加(均P<0.01)在miR-30a-5p抑制剂组表达显著减少(P<0.05)。在miR-30a-5p抑制剂组和FAP组中,FAPmRNA表达显著增加,而模拟组,siFAP 组和 miR-30a-5p 模拟物 + siFAP 组均降低(均 P<0.01)。miR-30a-5p模拟物+ siFAP和miR-30a-5p模拟物+ FAP组的蛋白表达变化也证实FAP siRNA或cDNA对miR-30a-5p表达无影响,相反miR-30a-5p可降低FAP表达。结论:MiR-30a-5p在口腔癌中低表达,而FAP在口腔癌中高表达,MiR-30a-5p直接靶向FAP并抑制其表达。第二部分miR-30a-5p和FAP对口腔癌中细胞增殖、侵袭和迁移作用的研究目的:探讨miR-30a-5p和FAP对口腔癌中细胞增殖、侵袭和迁移作用。方法:从口腔癌手术切除标本中获得66个口腔癌组织和25个相邻的正常组织(离肿瘤边缘至少2-3cm,术后病理检查证实没有肿瘤),纳入标准同Fu等的研究:即患者被诊断患有口腔癌,但之前没有接受过放疗和化疗,取得患者书面同意。于2014年-2015年在武汉大学人民医院及武汉大学口腔医院收集了两组人类口腔癌标本。所有临床标本在切除后立即收集,并保存在液氮中直至RNA提取。本研究经武汉大学人民医院及武汉大学口腔医院批准,所有参与者签署了知情同意书。获得上述标本后,进行相关细胞培养以及细胞转染,然后将处于对数生长期的转染细胞进行MTT测定,集落形成测定,划痕愈合测定,侵袭测定以研究miR-30a-5p和FAP如何调节细胞增殖,侵袭和迁移。结果:MTT 实验结果显示,miR-30a-5p 模拟物,FAPsiRNA,miR-30a-5p mimics + FAP siRNA 可显着降低 Tca-8113和 SCC-15细胞的活力,但 miR-30a-5p抑制剂和FAP增加细胞活力。因此,FAP可加速细胞增殖,其可被miR-30a-5p逆转减少。考虑到miR-30a-5p模拟物,FAPsiRNA,miR-30a-5p模拟物+FAP siRNA组中的较小集落数以及miR-30a-5p抑制剂组和FAP组中较大的集落数,克隆形成测定验证了相同的结论。miR-30a-5p模拟物,FAPsiRNA,miR-30a-5p模拟物+ FAP siRNA组迁移能力较弱,而miR-30a-5p抑制剂组和FAP组则具有较强的迁移能力(P<0.01)。Tca-8113和SCC-15细胞系入侵细胞评估其侵袭能力,miR-30a-5p 模拟物,FAPsiRNA,miR-30a-5p 模拟物+FAPsiRNA 组表现出较弱的侵袭能力,而miR-30a-5p抑制剂和FAP组表现出较强的侵袭能力。结论:MiR-30a-5p通过下调FAP抑制口腔癌细胞的细胞增殖,迁移和侵袭。