结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,发病率呈逐年上升趋势。2010年美国癌症协会发布的统计报告指出,在美国男性和女性肿瘤患者中,发病率和病死率均上升,分别位列第2位和第3位。我国原本是结肠癌发病率比较低的国家,随着我国经济的发展、人们生活水平的提高及膳食结构的改变,近年来我国结肠癌发病率逐年上升。统计资料显示,我国男性结肠癌的发病率仅次于肺癌和胃癌,女性仅次于乳腺癌和子宫颈癌,均位列第三位,其术后5年生存率仅50%左右。目前研究表明,结肠癌可能起因于结肠上皮原癌基因突变、抑癌基因失活、基因组表观遗传学修饰改变和环境等多因素共同作用,但其确切机制仍不十分明了。深入研究结肠癌的发病机制,对结肠癌的早期诊断、治疗和改善患者生活质量有着十分重要的意义。miRNA (microRNA)是生物体内一类长度为21.25个核苷酸,内源性的非编码小分子单链RNA,主要通过转录后水平调节,抑制靶基因的表达。miRNA广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、组织器官发育等生理过程和肿瘤发生、发展、侵袭、转移等病理过程的调控。近年来,miRNA涉及到多种人类肿瘤,通过一系列不同的机制,miRNA功能的增强或减弱都影响了肿瘤的进程。正因为miRNA能调控肿瘤细胞的分化、增殖、存活及转移,所以无论正性还是负性的肿瘤相关miRNA,都可以为干预肿瘤的发生及发展提供强大的治疗策略。为了深入研究miRNA在结肠癌中的作用机制,首先,本课题组采用miRNA表达芯片筛选结肠癌组织和癌旁组织中差异表达miRNA分子,获得了一组结肠癌相关候选miRNA分子,其中miR-145差异表达最明显,相对于癌旁组织,结肠癌组织中miR-145表达水平显著下调,并在实时定量RT-PCR实验中得到了证实；其次,选取miR-145作为进一步研究对象,通过体内、体外实验研究miR-145在结肠癌中的生物学功能；最后在结肠癌细胞HCT116中通过荧光素酶活性分析和Western blot初步证明miR-145可以靶向调控转录因子SOX9。本研究首次提出“miR-145可能通过靶向调控转录因子SOX9参与结肠癌恶性表型发生”的假说,将为全面阐明miR-145在结肠癌中的作用机制奠定理论基础,更为结肠癌候选诊断分子和治疗药物的研发提供理论依据。第一部分结肠癌相关候选miRNA的筛选与验证目的：探讨结肠癌组织和癌旁组织中miRNA的表达差异,获得结肠癌相关的候选miRNA分子。方法：对6例结肠癌组织和癌旁组织进行miRNA表达芯片检测,对感兴趣的差异表达miRNA分子采用实时定量RT-PCR进行验证。结果：1. miRNA差异表达谱分析发现,51个miRNA在结肠癌组织和癌旁组织表达有差异,差异均在2倍变化以上,具有统计学意义。其中,24个miRNA在结肠癌组织中表达下调,27个miRNA表达上调。相对于癌旁组织,结肠癌组织中miR-145和miR-143表达下调3.492和2.899倍,结肠癌组织中miR-96表达上调3.083倍。2.实时定量RT-PCR检测显示结肠癌组织中miR-145和miR-143表达水平相对癌旁组织下调3.533倍和2.425倍,miR-96表达水平相对癌旁组织上调2.363倍。结论：相对于癌旁组织,结肠癌中miRNA具有差异表达谱,miR-145表达水平变化与结肠癌密切相关,可供进一步研究。第二部分miR-145体外抑制结肠癌细胞HCT116增殖的实验研究目的：体外实验研究miR-145在结肠癌细胞HCT116中的生物学功能。方法：1.采用PCR扩增miR-145基因片段,将其克隆入真核表达载体pCMV-myc中,构建重组质粒pCMV-miR-145。2.酶切及DNA测序鉴定重组质粒后,脂质体法转染结肠癌细胞HCT116,运用实时定量RT-PCR检测转染后细胞中miR-145的表达情况。3.分别运用CCK8、流式细胞术和细胞划痕试验检测过表达miR-145对HCT116细胞增殖、细胞周期和迁移能力的影响。结果：1.成功构建了miR-145的真核表达载体pCMV-miR-145。实时定量RT-PCR证明转染该载体后,相对于空载体转染组,HCT116细胞中miR-145表达水平上升754倍。2.相对于对照组,真核表达载体pCMV-miR-145转染组G1期百分比升高(62.80±1.22%vs51.61±0.91%),吸光度值降低(0.345±0.032vs0.632±0.033),划痕中央区细胞数目减少(176±24vs276±26)。结论：体外过表达miR-145,可导致结肠癌细胞HCT116细胞周期发生G1期阻滞、细胞增殖速度变慢、细胞迁移能力降低。第三部分miR-145抑制裸鼠皮下移植瘤的实验研究目的：体内实验研究miR-145在结肠癌中的生物学功能。方法：建立结肠癌细胞HCT116裸鼠皮下移植瘤模型,观察过表达miR-145对肿瘤体积大小、倍增时间的影响。结果：过表达miR-145后,肿瘤体积明显减少(368.18±78mm3vs914.14±204mm3)、倍增时间延长(6.5±1.5天vs3.8±0.9天)。结论：miR-145可在体内抑制结肠癌细胞HCT116增殖。第四部分miR-145抑制结肠癌细胞HCT116增殖机制的研究目的：探讨miR-145抑制结肠癌细胞HCT116增殖功能的可能机制。方法：1.采用生物信息学分析miR-145的下游靶基因及其与靶基因的结合位点。2.构建基于靶基因SOX9含miR-145结合位点的荧光素酶报告载体pMIR-Report, DNA测序鉴定重组质粒。3.将重组质粒转染入结肠癌细胞HCT116,检测荧光素酶活性的变化。4. Western-blot实验检测过表达miR-145和降低内源性miR-145水平时靶基因SOX9的表达变化。5.实时定量RT-PCR和Western-blot检测癌组织与癌旁组织中miR-145和SOX9及其下游分子MUC2的mRNA表达水平和蛋白表达水平。结果：1.生物信息学结合文献检索,确定转录因子SOX9为miR-145的潜在下游靶基因,SOX9的mRNA3’UTR区-282和-1402有两个可能结合位点。2.含有miR-145结合位点的pMIR-282和pMIR-1402,在过表达miR-145时,其荧光素酶活性相对空载体分别下降50.29%和59.83%；在对核心结合位点突变后,荧光素酶活性恢复,与野生型水平接近。3.过表达miR-145后,Western-blot检测显示SOX9蛋白显著下降,MUC2蛋白水平相应增加；通过化学修饰的反义寡核苷酸降低内源性miR-145表达水平后,Western-blot检测发现SOX9蛋白显著增加,MUC2蛋白表达减少。4.相对于癌旁组织,miR-145的mRNA水平在癌组织中下调,SOX9的mRNA水平相应增加,MUC2的mRNA水平相应下降,同时,癌组织中SOX9的蛋白水平上调,其下游MUC2因为受到SOX9抑制其蛋白水平下降。结论：miR-145可能通过调节SOX9及下游分子MUC2抑制结肠癌细胞增殖。