研究背景：宫腔粘连(intrauterine adhesion, IUA)是指由于子宫内膜损伤后内膜修复障碍,引起子宫内膜瘢痕修复,从而导致宫腔肌壁和(或)子宫颈管的全部或部分闭锁,常见于人工流产或自然流产刮宫术后。IUA可引起月经过少、闭经、周期性下腹痛、继发性不孕及产科严重并发症(如流产、早产、胎盘粘连、前置胎盘、胎盘植入和产后出血等),对女性的生殖健康造成严重威胁。IUA是全世界范围内普遍存在的疾病,目前已成为女性继发性不孕的第二大病因。宫腔镜检查和治疗是目前临床诊治的金标准,但是术后出现再粘连的现象较多。宫腔镜下宫腔粘连分离术后的子宫内膜修复需要一段时间,在修复期间容易发生再粘连。防治术后再粘连的方法很多,多数学者倾向于以物理屏障治疗为主的综合治疗,如放置宫内节育器加用雌激素、放置小儿球囊导尿管、放置各种材质制作的宫腔内装置、宫腔注射透明质酸胶体、几丁糖、羊膜移植等治疗。其中以宫腔镜下粘连分离术并辅以放置宫内节育器、雌激素的联合治疗方法为主,但目前尚没有一个较为理想的防治方法。因此,防治术后再粘连已成为临床医生密切关注的问题。国内外学者也采取应用一些防粘连材料,取得了一定的防粘连效果,月经症状也有一定的改善,但妊娠率及分娩率仍不理想。研究学者一致认为,宫腔粘连的治疗效果不能单纯的仅从改善临床月经症状来评估,更重要的是要提高患者的临床妊娠率及活产率。氧化再生纤维素防粘连膜(Interceed)是经氧化氮处理的可吸收人造纤维织物,具有良好的生物相容性、可降解性、无毒性及安全有效性等优点。目前已广泛用于普外科及妇产科盆腹腔手术中,其预防腹腔及盆腔粘连效果十分明确,但将Interceed用于宫腔的研究甚少,本研究团队前期已成功的将Interceed联合宫内节育器及雌激素用于宫腔粘连分离术后的治疗,取得了较好的防粘连效果,但由于观察时间尚短,大部分患者仍在治疗中,其妊娠率还未见显著提高。胚胎成功着床的关键因素在于胚胎质量和子宫内膜容受性。随着辅助生殖技术的发展,胚胎质量得到了显著提高,但胚胎种植率低仍是限制人类辅助生殖技术发展的瓶颈问题。子宫内膜容受性反映了子宫内膜对胚胎的接受能力,即子宫内膜处于一种允许囊胚定位、黏附、侵入并使内膜间质发生改变,从而导致胚泡成功植入内膜组织的状态。子宫内膜容受性降低成为胚胎种植率低的主要因素。目前研究认为,胞饮突的表达和整合素αvβ3是公认的子宫内膜容受性标志物。子宫内膜容受性具有严格的时空特异性,人胞饮突在排卵后6d-8d出现,持续不到48h。家兔的胞饮突表达在交配后的7d-8d,此期正是胚泡开始与子宫内膜附着的时期。在着床窗期,整合素αvβ3与胞饮突同步出现。目前国内外对于IUA患者子宫内膜容受性的研究甚少,有关Interceed治疗后对IUA患者子宫内膜容受性的影响也未见研究报告,为此,本研究采用机械和感染双重损伤法构建新西兰大白兔IUA动物模型,再予以Interceed联合雌激素治疗,通过观察子宫内膜形态学、组织学等一系列的变化,评估该方法治疗IUA的疗效；通过观察着床窗期子宫内膜胞饮突和整合素αvβ3的表达,评估该方法对子宫内膜容受性的影响,从而评估Interceed联合雌激素治疗IUA的安全性和有效性,为临床IUA的治疗提供理论依据。第一章Interceed联合雌激素治疗兔宫腔粘连的疗效目的：采用机械及感染双重损伤法构建新西兰大白兔IUA动物模型,给予宫腔内置入Interceed和肌注雌激素联合治疗,探讨其疗效,为临床治疗提供理论依据。方法：1.健康成年雌性未孕普通级新西兰大白兔96只,随机分为6组,每组各16只。(1)正常对照组：行假手术,不造模。(2) Interceed对照组：在正常兔子宫宫腔内置入Interceed。(3)模型组：建模后不做任何治疗。(4) Interceed治疗组：建模后1w宫腔内置入Interceed治疗。(5)雌激素治疗组：建模后1w大腿肌注苯甲酸雌二醇(0.5mg/kg),每4天注射1次,共2次。(6)联合治疗组：建模后1w宫腔内置入Interceed同时肌注苯甲酸雌二醇(0.5mg/kg),每4天注射1次,共2次。其中后4组均采用双重损伤法(刮宫及脂多糖棉线置入)造模。此造模方法是本研究团队前期研究工作中成功自创及应用的方法,重复性良好,具体造模过程见正文。2.每组分别在治疗前(即建模后1w)、治疗后1W、2W、4w各取4只,采集耳缘静脉血,放射免疫法检测血清中雌二醇的浓度；处死后收集双侧子宫组织,肉眼观察子宫的解剖学变化；HE染色观察子宫内膜形态及进行腺体计数；Masson染色检测子宫内膜纤维化程度；IHC法检测子宫内膜TGF-p1的蛋白表达。3.采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析,所有实验数据用均数±标准差表示,进行方差齐性检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),各组间两两比较：若符合方差齐性,则采用LSD检验；若不符合方差齐性,则采用iTamhane’s检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.各组子宫解剖学观察正常对照组子宫外观呈粉红色,子宫内膜区呈灰白色,可见腺体开口,表面无出血或充血点。Interceed对照组解剖学结构无明显改变,可观察到Interceed置入宫腔2w完全吸收。模型组在随建模时间的延长子宫水肿和宫腔积水程度逐渐加重,腺体极少,子宫内膜厚薄不均。Interceed治疗组、雌激素治疗组及联合治疗组随着治疗时间的延长,子宫水肿和宫腔积水情况逐渐减轻,腺体不同程度修复,其中联合治疗组治疗后4w子宫解剖学形态基本恢复正常。实验各组卵巢、输卵管等其他器官外观均无明显变化。2.各组兔血清雌二醇浓度比较各组血清雌二醇浓度的方差分析显示：不同处理组间有显著性差异(F=6.585,P=0.000)；处理后不同时间之间亦有显著性差异(F=9.501,P=0.000)。(1)治疗前：6组间兔血清雌二醇浓度比较差异无统计学意义(F=0.564,P=0.726)。(2)治疗后1W：6组间血清雌二醇浓度比较差异有统计学意义(F=412.198,P<0.000)。联合治疗组、雌激素治疗组显著高于其他各组(P<0.05),余各组与正常对照组比较差异均无统计学意义(PInterceed对照组=0.664,P模型组=0.631,PInterceed治疗组＝0.573)。(3)治疗后2W：6组间血清雌二醇浓度比较差异有统计学意义(F=35.301,P<0.000)。联合治疗组、雌激素治疗组显著高于其他各组(P<0.05)。余各组与正常对照组比较差异均无统计学意义(PInterceed对照组=0.804,P模型组=0.764,PInterceed治疗组=0.737)。(4)治疗后4W：6组间血清雌二醇浓度比较差异无统计学意义(F=1.107,P=0.391)。3.HE染色下子宫内膜腺体数量的比较HE染色下正常兔子宫分内膜层、肌层及浆膜层,其中内膜层可分为黏膜层及黏膜下层,黏膜层为单层柱状上皮细胞覆盖,黏膜下可见腺体、血管和少量成纤维细胞。随着治疗时间的延长,三个治疗组子宫内膜腺体数量均呈不同程度增加。(1)治疗前：6组间腺体数量比较差异有统计学意义(F=46.992,P<0.001)。后4组与正常对照组相比差异均有统计学意义(P模型组=0.000,PhIterceed治疗组=0.000,P雌激素治疗组=0.000, P联合治疗组=0.000)。Interceed对照组与正常对照组比较无统计学差异(P=0.674)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组比较差异均无统计学差异(P=0.766,P=0.692)。(2)治疗后1W.6组间腺体数量比较差异有统计学意义(F=34.428,P<0.001)。后4组与正常对照组相比差异均有统计学意义(P模型组=0.000,PInterceed治疗组=0.000,P雌激素治疗组=0.000, P联合治疗组=0.002)。Interceed对照组与正常对照组比较差异无统计学意义(P=0.774)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组比较差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.007)。(3)治疗后2w：6组间腺体数量比较差异有统计学意义(p17.758,P<0.001)。模型组、Interceed治疗组和雌激素治疗组分别与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P模型组=0.000,P Interceed治疗组=0.040,P雌激素治疗组=0.004)。Interceed对照组、联合治疗组分别与正常对照组比较差异均无统计学意义(P=0.907,P=0.711)。联合治疗组分别与Interceed治疗组、雌激素治疗组比较差异均有统计学意义(P=0.017,P=0.002)。(4)治疗后4W.6组间腺体数量比较差异有统计学意义(F=8.832,P<0.001)。模型组与正常对照组比较差异有统计学意义(P=0.000),余4组与正常对照组比较差异均无统计学意义(PInterceed对照组=0.517,P Interceed治疗组=0.104,P雌激素治疗组=0.108,P联合治疗组=0.186)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组比较均有显著性差异(P=0.004,P=0.005)。4.Masson染色下子宫内膜纤维化面积比的比较Masson染色下可观察到正常兔子宫内膜间质内含有少量排列整齐的蓝色胶原纤维。随着治疗时间的延长,三个治疗组子宫内膜纤维化程度逐渐减轻。(1)治疗前：6组间纤维化面积比率比较差异有统计学意义(F=79.978,P<0.001)。后4组与正常对照组比较差异均有统计学意义(P模型组0.000,P Interceed治疗组=0.000, P雌激素治疗组=0.000,P联合治疗组=0.000)。Interceed对照组与正常对照组比较差异无统计学意义(P=0.836)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组比较差异均无统计学意义(P=0.605,P=0.279)。(2)治疗后1W：6组间纤维化面积比率比较差异有统计学意义(F=60.685,P<0.001)。模型组、Interceed治疗组、雌激素治疗组分别与正常对照组比较差异均有统计学意义(P模型组=0.000,PIntereed治疗组=0.000,P雌激素治疗组=0.000)。Interceed对照组和联合治疗组分别与正常对照组比较差异无统计学意义(P=0.941,P=0.744)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组比较差异均有统计学意义(P=0.001,P=0.002)。(3)治疗后2W：6组间纤维化面积比率比较差异有统计学意义(F=150.764,P<0.001)。模型组和雌激素治疗组分别与正常对照组比较差异均有统计学意义(P模型组=0.000,P雌激素治疗组=0.007)。Interceed对照组、Interceed治疗组和联合治疗组分别与正常对照组比较差异均无统计学意义(PInterceed对照组=0.977,PInterceed治 疗组=0.641,P联台治疗组=0.206).联合治疗组与Interceed治疗组差异无统计学意义(P=0.707),与雌激素治疗组比较差异有统计学意义(P=0.000)。(4)治疗后4W：6组间纤维化面积比率比较差异有统计学意义(F=155.768,P<0.001)。模型组与正常对照组比较差异有统计学意义(P=0.000),余各组与正常对照组比较差异均无统计学意义(PIntereed对照组=0.998,P Interceed治疗组=0.254,P雌激素治疗组=0.387,P联合治疗组=0.062)。联合治疗组与雌激素治疗组比较差异有统计学意义(P=0.000),与Interceed治疗组比较差异无统计学意义(P=0.996)。5.各组子宫内膜TGF-p1蛋白水平表达分析TGF-β1蛋白在子宫内膜腔上皮、腺上皮及间质中均有表达,呈棕黄色颗粒状。(1)治疗前：6组间子宫内膜TGF-β1蛋白表达量比较差异有统计学意义(F=55.664,P<0.001)。后4组与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P模型组=0.000,PInterc,eed治疗组=0.000,P雌激素治疗组=0.000,P联合治疗组=0.000)。Interceed对照组与正常对照组比较差异无统计学意义(P=0.989)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组相比均无显著性差异(P=0.534,P=0.584)。(2)治疗后1W：6组间子宫内膜TGF-β1蛋白表达量比较差异有统计学意义(F=59.684,P<0.001)。模型组、Interceed治疗组、雌激素治疗组和联合治疗组分别与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P模型组=0.000,P Interceed治疗组=0.000,P雌激素治疗组=0.000,P联合=0.000)。Interceed对照组与正常对照组比较差异无统计学意义(P=0.066)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组比较差异均有统计学意义(P=0.009,P=0.043)。(3)治疗后2W：6组间子宫内膜TGF-p1蛋白表达量比较差异有统计学意义(F=102.618,P<0.001)。模型组、Interceed治疗组、雌激素治疗组分别与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P模型组=0.000,P Interceed治疗组=0.000,P雌激素治疗组=0.007).Interceed对照组和联合治疗组分别与正常对照组比较差异均无统计学差异(P Interceed对照组=0.971,P联合治疗组=0.104)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组比较差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.009)。(4)治疗后4W-6组间子宫内膜TGF-p1蛋白表达量比较差异有统计学意义(F=174.634,P<0.001)。模型组和Interceed治疗组分别与正常对照组比较差异有统计学意义(P=0.000,P=0.002),余各组与正常对照组比较,差异均无统计学意义(P Interceed对照组=0.940,P雌激素治疗组=0.608,P联合治疗组=0.993)。联合治疗组与Interceed治疗组比较差异有统计学意义(P=0.001),与雌激素治疗组比较差异无统计学意义(P=0.170)。结论：1.机械和感染双重损伤法可构建相对稳定的新西兰大白兔IUA动物模型,重复性好,可通过此模型评价Interceed联合雌激素治疗宫腔粘连的疗效。2.Interceed用于兔宫腔后无炎症等反应,对正常子宫内膜也无不良影响。3.Interceed治疗组、雌激素治疗组和联合治疗组,三种方法治疗IUA后均可在一定程度上逆转子宫内膜腺体数量的表达、子宫内膜间质纤维化程度和子宫内膜TGF-p1蛋白的表达,其中以联合治疗方法效果最佳。第二章Interceed联合雌激素治疗兔宫腔粘连对子宫内膜容受性影响的研究目的：采用机械和感染双重损伤法构建新西兰大白兔IUA动物模型,给予宫腔内置入Interceed和肌注雌激素联合治疗,通过观察雌兔着床窗期子宫内膜胞饮突和整合素αvβ3蛋白的表达情况,探讨其对子宫内膜容受性的影响,为临床治疗提供理论依据。方法：1.健康成年雌性未孕普通级新西兰大白兔144只,随机分为6组,每组各24只,各组建模及治疗方法同第一章。①正常对照组；②Interceed对照组；③模型组；④Interceed治疗组；⑤雌激素治疗组；⑥联合治疗组。治疗后第2w开始观察各组雌兔2个正常发情周期(8d～15d/周期),于发情期用消毒过的圆滑玻璃棒涂上甘油刺激雌兔的阴道,诱发排卵形成雌兔假孕模型。2.分别在假孕后第6d、7d、8d各组各处死8只雌兔,立即剖腹取出双侧子宫,所得标本分为2份：一份纵行剖开,用PBS液反复冲洗宫腔数次,固定于2.5%戊二醛溶液中行扫描电镜观察子宫内膜上胞饮突的表达；一份用4%多聚甲醛固定24h,行IHC染色观察子宫内膜上整合素αβ3的蛋白表达。3.采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析,所有实验数据用均数±标准差表示,进行方差齐性检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),各组间两两比较：若符合方差齐性,则采用LSD检验；若不符合方差齐性,则采用Tamhane’s检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.各组雌兔着床窗期子宫内膜胞饮突的表达扫描电镜下见在胞饮突发育之前,子宫内膜表面由含有微绒毛的无纤毛细胞覆盖。胞饮突在子宫内膜表面呈较大的蘑菇样突起。(1)正常对照组：假孕第6d子宫内膜表面见大量细胞开始突向宫腔,微绒毛缩短、消失,胞饮突开始形成,即为发育中的胞饮突；假孕第7d子宫内膜表面见表达丰富、完全发育的胞饮突,表面裸露,无微绒毛,大小一致,边界清楚,呈光滑的蘑菇样突起；假孕第8d胞饮突表面皱缩,呈塌陷状,即为退化的胞饮突。(2)Interceed对照组：假孕第6d子宫内膜表面见微绒毛缩短,大量细胞开始突起,即发育中的胞饮突；假孕第7d子宫内膜表面见丰富的膜状突起,形态较规则,偶见短而细的的微绒毛,即为发育完全的胞饮突；假孕第8d微绒毛再次出现,突起表面皱褶增多,为退化的胞饮突。(3)模型组：假孕第6d子宫内膜表面见大量微绒毛,可见少数突起的细胞,呈局灶性分布,发育不同步,可见少数发育中的胞饮突及发育完全的胞饮突；假孕第7d子宫内膜表面胞饮突被抑制,分布明显稀少,呈局灶性生长,发育不同步,部分为完全发育的胞饮突,部分为开始衰退的胞饮突；假孕第8d微绒毛再次出现,胞饮突消失。(4)Interceed治疗组：假孕第6d子宫内膜表面见大量细胞略向宫腔突起,大小不一致,微绒毛开始缩短,为发育中的胞饮突；假孕第7d子宫内膜表面表达丰富的胞饮突,大小不一致,发育不同步,部分为发育完全的胞饮突,部分为发育中的胞饮突；假孕第8d胞饮突开始减少,发育不同步,部分胞饮突表面皱缩退化,部分为发育完全的胞饮突。(5)雌激素治疗组：假孕第6d子宫内膜表面见大量细胞向宫腔突起,形态饱满,大小不一致,微绒毛缩短明显,为发育中的胞饮突；假孕第7d子宫内膜表面表达丰富的胞饮突,大小不一致、形态不规则、发育不同步,部分为发育完全的胞饮突,部分为开始退化的胞饮突；假孕第8d见突起皱缩萎陷,为退化的胞饮突。(6)联合治疗组：假孕第6d子宫内膜表面见大量细胞向宫腔突起,形态饱满,大小较一致,微绒毛缩短明显,为发育中的胞饮突；假孕第7d子宫内膜表面见表达丰富的胞饮突,大小较一致、形态较规则,边界清楚,大部分为完全发育的胞饮突,极少数为开始衰退的胞饮突；假孕第8d见大量胞饮突皱缩增多,分布均匀,为退化的胞饮突。2.各组着床窗期子宫内膜上整合素αvβ3蛋白的表达在着床期,整合素αvβ3表达于子宫内膜的腔上皮与腺上皮的胞浆中,且表达强弱不一。(1)假孕第6d：6组间子宫内膜整合素αvβ3蛋白表达量比较差异有统计学意义(F=33.884,P<0.001)。模型组、Interceed治疗组和雌激素治疗组分别与正常对照组比较差异均有统计学意义,P值分别为：P模型组=0.000,PInterceed治疗组=O.005,P雌激素治疗组=0.002。联合治疗组、Interceed对照组分别与正常对照组比较差异均无统计学意义(P=0.100,P=0.891)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组比较差异均有统计学意义(P=0.001,P=0.006)。(2)假孕第7d：6组间子宫内膜整合素avβ3蛋白表达量比较差异有统计学意义(F=22.761,P<0.001)。模型组、Interceed治疗组和雌激素治疗组分别与正常对照组比较差异均有统计学意义,P值分别为：P模型组=0.000,PInterceed治疗组=0.006,P雌激素治疗组=0.003。联合治疗组、Interceed对照组分别与正常对照组比较差异均无统计学意义(P=0.110,P=0.465)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组比较差异均有统计学意义(P=0.032,P=0.023)。(3)假孕第8d：6组间子宫内膜整合素αvβ3蛋白表达量比较差异有统计学意义(F=25.546,P<0.001)。模型组、Interceed治疗组、雌激素治疗组和联合治疗组分别与正常对照组比较差异均有统计学意义,P值分别为：P u组=0.006,PInterceed治疗组=0.006,P雌激素泊疗组=0.008,P联合治疗组=0.018。Interceed对照组与正常对照组比较差异无统计学意义(P=0.460)。联合治疗组分别与Interceed治疗组和雌激素治疗组比较差异均有统计学意义(P=0.007,P=0.048)。结论：1.模型组子宫内膜胞饮突表达呈微量局灶性分布、子宫内膜整合素αvβ3蛋白表达显著降低,提示机械和感染双重损伤子宫内膜后容受性降低。2.Interceed对照组子宫内膜上整合素αvβ3蛋白的表达和胞饮突的表达、发育与正常对照组相似,提示Interceed对正常子宫内膜容受性无明显不良影响。3. Interceed治疗组、雌激素治疗组和联合治疗组,3种方法治疗IUA后均可在一定程度上增加子宫内膜整合素αvβ3蛋白的表达和改善子宫内膜胞饮突的表达和发育。4.联合治疗组治疗IUA后子宫内膜上胞饮突发育趋于同步、整合素αvβ3蛋白的表达量达到最高,提示联合治疗方法可最大程度改善IUA子宫内膜的容受性。