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目的:肺干细胞的增殖分化及稳态维持的失衡与多种呼吸系统疾病的发生发展密切相关,可能导致呼吸系统不同程度的病理改变和功能受损,因此探究肺干细胞损伤修复机制对于呼吸系统疾病的病生理机制研究及诊断治疗具有重要的指导意义。肺上皮细胞覆盖于呼吸道表面,保持气道和肺泡上皮结构的完整,同时维持肺功能的稳定。当肺上皮受到损伤后,可通过肺干细胞的自我更新及损伤修复来维持和恢复其数量和功能。肺上皮的修复存在多种机制,肺外干细胞(骨髓、外周血、胚胎等来源)可迁移到损伤的肺部对上皮进行修复,但肺内干细胞对气道上皮修复的贡献远远大于肺外干细胞,目前已知的肺内干细胞包括基底细胞、Club细胞、支气管肺泡干细胞及Ⅱ型肺泡细胞等。肺部干细胞的功能受其所处微环境包括成纤维细胞、毛细血管以及气道壁平滑肌细胞等的紧密调控。成纤维细胞可以分泌转化生长因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β),TGF-β通路可以促进干细胞分化、抑制增殖,但成纤维细胞是否利用TGF-β通路实现对干细胞的调控尚未见报道,本研究利用分子生物学和细胞生物学等手段,探究TGF-β通路在成纤维细胞调控气道上皮干细胞增殖中的作用机制,为增强气道上皮修复的治疗新方法提供理论依据。方法:1、利用酶消化法分离小鼠肺气道上皮细胞,流式细胞术筛选肺气道上皮干细胞。2、对气道上皮干细胞进行体外培养,除对照组只加入基本培养基外,实验组分别加入不同种类的肺成纤维细胞分泌的生长因子(FGF1、FGF2、FGF10、HGF)、TGF-β受体抑制剂SB431542、肺成纤维细胞、肺成纤维细胞+TGF-β抑制剂SB431542,利用倒置荧光显微镜观察、比较气道上皮干细胞增殖情况。3、用敲除肺干细胞TGF-β受体的小鼠(TGFβR-肺干细胞、SPC-Cre/TGFβRf/f)为实验组,未敲除基因小鼠为对照组,分别筛选气道上皮干细胞进行体外培养,培养时实验组与对照组各自分别加入基本培养基及TGF-β受体抑制剂SB431542,利用倒置荧光显微镜观察气道上皮干细胞增殖情况,并对干细胞克隆数量进行统计学分析。4、对肺成纤维细胞系MLg进行体外培养,设立实验组及对照组,对照组加入基本培养基,实验组细胞培养过程中加入TGF-β受体抑制剂SB431542,处理48小时后利用显微镜观察细胞的数量及形态变化,提取细胞RNA,应用实时定量PCR方法(q RT-PCR)测定成纤维细胞分泌的不同生长因子(FGF1、FGF2、FGF4、FGF10、HGF)的基因表达量。结果:1、肺气道上皮干细胞的流式筛选结果:除去细胞碎片和7-AAD阳性标记的死细胞,分馏出肺组织活细胞;除去CD31/34/45-APC-CY7标记的内皮细胞、基质细胞和造血细胞,Ep CAM-PE-CY7阳性标记的细胞为上皮细胞;最后上皮细胞中Sca-1-APC和GFP-FITC双阳性标记的细胞即为气道上皮干细胞。2、肺成纤维细胞分泌的生长因子对气道上皮干细胞的增殖起促进作用。3、TGF-β通路对气道上皮干细胞的增殖无直接调控作用。4、肺成纤维细胞通过抑制TGF-β通路间接促进气道上皮干细胞的增殖。5、TGF-β受体抑制剂SB431542对肺成纤维细胞的形态及数量无明显影响。6、TGF-β受体抑制剂SB431542可上调肺成纤维细胞分泌的生长因子的基因表达水平。结论:肺成纤维细胞通过抑制TGF-β通路上调其分泌的生长因子(FGFs、HGF)的基因表达水平,进而促进气道上皮干细胞的增殖,提示TGF-β通路在肺部气道上皮干细胞增殖调控中起重要作用,且肺干细胞的功能受其所处微环境成纤维细胞的紧密调控。