论文部分内容阅读
1.目的阿片类药物成瘾是一种慢性复发性脑病,戒毒是当今世界面临的一个具有重要科学和社会意义的难题。现有的药物戒毒方法虽能减轻吸毒者的戒断反应,但顽固的心理(精神)依赖使得复吸率高达95%以上。研究表明,NMDA受体参与了阿片依赖的形成,因此针对NMDA受体研究防治阿片成瘾药物成为最近研究的热点。已证明,竞争性和非竞争性NMDA受体拮抗剂能够抑制吗啡、可卡因和苯丙胺诱导的位置偏爱效应。本研究利用视频跟踪-计算机自动分析条件性位置偏爱(Conditioned PlacePreference,CPP)实验系统,研究NMDA受体拮抗剂芋螺毒素Conantokin G的类似物[Glu3,4,7,10,14]-Conantokin G(Glu-Con G)对吗啡诱导小鼠CPP表达的影响,评价该类似物在干预吗啡精神依赖方面的药效;结合蛋白质印迹技术检测细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)磷酸化改变情况,探讨Glu-Con G干预吗啡精神依赖可能的分子机制。2.材料和方法2.1实验动物清洁级成年雄性昆明种小鼠,体重18~22g。2.2主要药物及试剂盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂);[Glu3,4,7,10,14]-Conantokin G(Glu-Con G)(Sigma公司);多克隆抗p-ERK1/2抗体(Cell Signal公司);多克隆抗ERK1/2抗体(Cell Signal公司);单克隆抗β-Actin抗体(Sigma公司);辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(北京博奥森生物技术有限公司)。2.3主要实验装置及软件视频跟踪一计算机自动分析CPP实验系统;BIO-RAD电泳及转膜装置;Rat/MiceTracking软件;Quantity-One软件;SPSS统计软件。2.4实验方法2.4.1 Glu-Con G对CPP表达的影响:成年雄性昆明小鼠d1、d3、d5、d7腹腔注射(i.p.)吗啡(5mg/kg)后放入白盒内自由活动50 min,d2、d4、d6、d8给予生理盐水后放置黑盒训练50 min。对照组小鼠均给予生理盐水,其它处理同吗啡组小鼠。Glu-Con G干预CPP表达组在实验的d9于CPP测试前半小时,侧脑室注射(i.c.V.)不同剂量的Glu-Con G(0、30、60、120pmol),给药容量为2μl/只,观察其对吗啡诱导CPP表达的干预作用。2.4.2蛋白质印迹技术检测ERK1/2磷酸化情况取海马(H)、前额叶皮质(PFC)和纹状体提取总蛋白,灌制SDS-PAGE凝胶(10%分离胶和5%积层胶),每孔30μg上样,70V恒压电泳后恒流300mA湿法电转膜。5%脱脂奶粉封闭3h后抗p-ERK1/2一抗(1:2000)4℃孵育过夜,TBST洗膜后放入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1:5000)室温孵育2h,显影、定影。再将膜放入洗膜缓冲液(Stripping buffer)中50℃水浴振摇30min,5%脱脂奶粉封闭3h后抗ERK1/2一抗(1:2000)4℃孵育过夜,洗膜后二抗(1:5000)孵育2h,显影、定影。再用TBST液快速洗膜,抗β-Actin一抗(1:2000),室温孵育2h,洗膜后抗Actin二抗室温孵育2h后显影、定影。2.5实验观察指标及统计分析条件性位置偏爱与蛋白质印迹检测结果均用均数士标准差表示。小鼠白盒停留时间(s)作为位置偏爱指标,用Kruskal-Wallis法进行组间差异的比较,然后进行多个样本均数间的多重比较。总运动距离作为运动活性指标,穿梭次数、总中心徘徊距离、总中心停留时间、白盒中心徘徊距离、白盒中心停留时间作为探索活动指标,方差齐者用方差分析进行组间差异的比较,并用LSD法进行多个样本均数的两两比较,方差不齐者用Kruskal-Wallis法进行组间差异的比较,然后进行多个样本均数间的多重比较。P<0.05视为有统计学差异。对位置偏爱、运动活性、探索活动等指标,用偏相关分析检验指标之间的两两相关性。P<0.05视为有统计学差异。Western blot胶片用GS-800扫描仪扫描入计算机,用Bio-rad quantity one densitomonter图像分析软件计算每张胶片中各条带的调整后相对灰度与条带面积的乘积,以相应条带的内参Actin的平均灰度做标准,计算ERK1/2和p-ERK1/2各条带的相对比值,以对照组的相对比值作为100%,进行归一化处理后半定量分析。P<0.05视为有统计学差异。3.结果3.1吗啡诱导的条件性位置偏爱模型的建立连续三天的天然偏爱结果显示:小鼠在黑盒停留时间(s)较白盒长(第一天黑盒和白盒停留时间分别为489.9±147.0s和410.1±147.0s,P<0.05;第二天黑盒和白盒停留时间分别为520.7±120.9s和379.3±120.9s,P<0.05;第三天黑盒和白盒停留时间分别为520.5±128.3s和379.5±128.3s,P<0.05)。经过8天条件化训练后,5mg/kg吗啡组小鼠在白盒停留时间显著长于生理盐水对照组(分别为606.8±127.3s和313.8±181.2s,P<0.05)。3.2 Glu-Con G对吗啡诱导的CPP表达的影响吗啡诱导的CPP表达阶段,芋螺毒素类似物Glu-Con G处理组(0、30、60、120 pmol)同吗啡组白盒停留时间(606.8±127.3s)相比,呈剂量相关性减少(0pmol组白盒停留时间为565.4±273.3s,P=0.916;30pmol组白盒停留时间为534.3±101.8s,P=0.093;60pmol组白盒停留时间为426.1±123.9s,P=0.016;120pmol组白盒停留时间为378.1±250.9s,P=0.046)。反映运动活性的总运动距离以及反映探索活性的穿梭次数、总中心徘徊距离、总中心停留时间、白盒中心徘徊距离和白盒中心停留时间各组间比较无显著差别(P>0.05)。3.3各指标间相关性分析指标间的偏相关分析结果表明:代表位置偏爱指标的白盒停留时间与代表探索活性的白盒中心停留时间(r=0.452,P<0.05)存在相关性;代表运动活性指标的总运动距离与穿梭次数(r=0.439,P<0.05)、总中心徘徊距离(r=0.574,P<0.05)、白盒中心徘徊距离(r=0.501,P<0.05)之间存在相关性;反映探索活性的5个指标之间,穿梭次数与总中心徘徊距离(r=0.505,P<0.05)、总中心停留时间(r=0.274,P<0.05)、白盒中心徘徊距离(r=0.454,P<0.05)之间存在相关关系,而与白盒中心停留时间(r=0.191,P=0.132)无相关关系;总中心徘徊距离与总中心停留时间(r=0.718,P<0.05)、白盒中心徘徊距离(r=0.827,P<0.05)、白盒中心停留时间(r=0.403,P<0.05)之间存在相关关系;总中心停留时间与白盒中心徘徊距离(r=0.679,P<0.05)、白盒中心停留时间(r=0.801,P<0.05)之间存在相关关系;白盒中心徘徊距离与白盒中心停留时间(r=0.641,P<0.05)之间存在相关关系。3.4 ERK1/2和p-ERK1/2在Glu-Con G干预吗啡诱导CPP表达前后的变化PFC、HP以及纹状体脑区中ERK1/2表达在各处理组之间未见差别(P>0.05);吗啡组的PFC、HP以及纹状体脑区p-ERK1/2蛋白增多,均明显高于对照组(P<0.05),同吗啡组相比,30、60和120pmol Glu-Con G干预组和盐水组HP以及纹状体脑区中p-ERK1/2蛋白减少(P<0.05),60和120pmol Glu-Con G干预组和盐水组PFC脑区中p-ERK1/2蛋白减少(P<0.05)。4.结论1.小鼠天然偏爱黑盒,5mg/kg吗啡可以成功建立小鼠对白盒的条件性位置偏爱;2.Glu-Con G剂量相关性抑制吗啡诱导的小鼠条件性位置偏爱表达,其有效剂量范围在30~60pmol(相当于0.0015~0.003mg/kg),所用剂量的Glu-Con G并不引起小鼠运动活性和探索活性异常;3.吗啡可以使海马、前额叶皮质和纹状体脑区的p-ERK1/2水平增加,但不影响ERK1/2的表达;4.Glu-Con G可以呈现剂量相关性减少吗啡诱导海马、前额叶皮质和纹状体脑区p-ERK1/2,为证明NMDA受体和ERK1/2参与吗啡成瘾提供了更多的实验依据。