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20世纪90年代,在生命科学领域中出现了一门新兴的尖端技术----基因芯片技术,它综合了分子生物学、微电子学、物理、化学等领域的最新科学技术,经过几年的发展,目前已经广泛应用于人类基因研究中。然而在基因芯片的研究过程中,一些技术细节上需要进一步的摸索。此外在神经科学领域中,神经元的分化机理一直是研究热点。全反式维甲酸作为临床上一种具有良好抗肿瘤作用的药物,它可诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化,并抑制其生长,这一模型一直是研究神经元分化的经典模型。由于参与这一过程的机制比较复杂,因而需要采用基因芯片技术进一步研究。本课题根据这一线索,采用马文丽、郑文岭等建立的RD技术制备SH-SY5Y细胞基因表达谱芯片,在基因芯片的制备上做了一些研究,同时应用自制的基因表达谱芯片,研究了RA诱导SH-SY5Y细胞分化的基因表达变化。 研究内容分为三部分: 1、应用RD技术构建SH-SY5Y细胞基因片段文库。收集大量的基因探针,这是基因芯片制作的前提。在文库构建过程中,对其中的一些技术细节,如在DNA银染与RD技术结合、PCR产物纯化、探针数据的管理、EST的生物信息学分析等方面进行了探索。 2、基因芯片的制作研究。主要研究了影响基因芯片的杂交条件、基因芯片的重复利用以及基因芯片打印后检测等方面。 3、基因芯片在RA诱导SH-SY5Y细胞分化中的应用。首先应用低浓度的RA处理SH-SY5Y细胞,促使细胞分化成神经元表型,然后提取总RNA并进行标记,与制备的基因表达谱芯片进行杂交,检测基因表达变化,查找差异表达基因。 实验结果: 1、将DNA银染技术与RD技术结合起来,分离基因片段,在PAGE胶上可发现,平均每组有7-10条DNA带,在日光灯下,带型清楚,可以快速分离EST片段,扩增后无杂带产生,直接可以用于载体克隆。2、采用CTAB进行PCR产物的纯化,以去除PCR产物中的引物和dNTP,所得产物可用于与T载体连接反应,以提高连接效率。3、用RD技术进行构建基因片段文库,共收集了1078条基因片段,目前测序结果分析表明,文库重复性小,证明该方法是一简便、效率高、快速的实用技术。4、运用FOXPRO编辑了基因片段数据库,可以方便地进行数据的贮存与管理。5、运用RD技术分离基因片段,对其中的一个EST运用生物信息学分析,提示该片段可能是一个新基因的一部分。6、运用RD技术所制备的靶基因片段,制备了SH一SYSY细胞基因表达谱芯片。该基因片段长度分布在250bP一75obP之间,杂交温度较均一,杂交动力学易于控制。7、标记的样品纯化后与芯片杂交,获得的杂交结果背景低,阳性信号的界限清楚。8、用氨基化的玻片制备的基因芯片,杂交后应用剥脱液脱掉探针,可以用于下一次的杂交,杂交结果相关性为0.97,p<0 .001,在三次内可以有较好的结果。9、根据RD技术制备芯片的特点,运用荧光标记通用引物对芯片进行打印后检测,检测基因芯片在打印中漏打或固化不良现象。10、用低浓度的RA作用于SH一SYSY细胞,9天后可以诱导SH一SYSY细胞长出突起,并且细胞的生长受到抑制,变得缓慢。11、用自制的SH一SYSY细胞基因表达谱芯片研究RA诱导前后基因表达变化,发现表达上调的基因有36个,表达下调的基因有7个,并对其进行了聚类分析,这对于在分子水平上全面地认识RA诱导SH一SYSY细胞分化的机制具有重要的意义。