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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科鼠尾草属多年生草本植物，其干燥根可以入药，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦和凉血消痈等功效，是临床治疗心脑血管系统疾病的常用药。丹参的主要有效成分为苯丙烷类化合物——丹酚酸和二萜醌类化合物——丹参酮。对化合物生物合成的调控，将为应用生物技术生产这些具有重要药用价值化合物提供科学依据。 本论文主要包括两方面内容:转录因子促进丹参酮的生物合成与pri-miR396b克隆与功能。 一、转录因子促进丹参酮的生物合成 植物次生代谢中，转录因子通过激活次生代谢产物合成途径中多个结构基因的表达，可有效地启动或关闭次生代谢合成途径，从而调节特定次生代谢物的合成。MYB型转录因子是植物中最大的转录因子家族，玉米转录因子ZmC1属于R2R3-MYB型转录因子。本实验室前期获得了ZmC1、ZmR和ZmC1/ZmR的过表达丹参毛状根，研究发现转ZmC1基因丹参毛状根中丹酚酸含量显著减低，且毛状根生长受到一定程度抑制。在此基础上，开展了如下工作: 1.1 丹参酮含量检测。转ZmC1和ZmC1/ZmR基因的丹参毛状根中的丹参酮类成分包括TA-Ⅰ、TA-ⅡA和CT的含量与对照相比均显著提高，其中转C1基因丹参毛状根总丹参酮含量为2.29±0.68 mg/g，是对照的2.2倍。 1.2 萜类途径基因转录水平检测。转ZmC1基因的丹参毛状根中，所有检测的萜类途径基因表达水平显著高于对照，其中SmMDC是对照的26.74±7.92倍。 1.3 SmMDC启动子克隆。采用染色体步移技术获得2024bp启动子序列，并应用PlantCare、PlantPan和SoftBerry在线软件对启动子顺式作用元件进行预测分析，发现了一些C1结合位点，如P(B-Myb)、C1 PBS/P和MYB PZm。 1.4 SmMDC启动子调控的双荧光素酶报告基因的瞬时表达。pSmMDC∷Luc瞬时表达结果证明，ZmC1对萜类途径基因的调控，很可能是直接与这些基因启动子区域相应的结合位点，如C1 PBS/P等作用，激活基因的转录表达，从而促进丹参酮的生物合成。 二、pri-miR396b克隆与功能 microRNA(miRNA)是一类真核生物中广泛存在的内源性非编码小RNA。miRNA在植物生长发育过程中的重要作用及代谢途径的双向调控作用，启发我们推测，转ZmC1基因毛状根表型变化和代谢产物的双向调控是否有miRNA参与。我们参照丹参近缘物种南欧丹参(Salvia sclarea)的18条miRNAs序列信息开展了如下工作: 2.1 运用psRNATarget软件对miRNA靶基因进行在线预测，结果显示，miR396可能与木质素合成相关，也参与生长发育等生理活动调控过程，且在丹参中有12个可能的GRF(Growth regulating factor，GRF)靶基因，由此确定以miR396为研究对象。 2.2 通过荧光定量对miR396b在转ZmC1毛状根中表达水平进行检测，结果表明，ZmC1丹参毛状根中miR396b表达水平显著上升。 2.3 丹参miR396b组织特异性分析表明miR396b在花中表达量最高，花萼、根、叶中的表达依次降低。 2.4 以文献中报道的丹参pre-miR396b为模板，通过5RACE和3RACE克隆获得pri-miR396b基因片段。 2.5 利用克隆的pri-miR396b基因片段，构建miR396b过表达载体，进行农杆菌的转化，目前获得48株转基因阳性毛状根，为后期miR396b功能研究奠定基础。