研究背景:近年的研究表明,肺癌的发病率和死亡率逐渐呈上升趋势,至2014年,肺癌的死亡率已局于恶性肿瘤首位。目前,综合治疗方案使疗效有所提高,但肺癌的5年生存率仍不足20%,癌组织的侵袭和转移是导致肺癌患者死亡的主要原因。肺癌患者的预后大多不良,因此,早发现、早诊断、早治疗对于提高治愈率和生存率至关重要。探讨肺癌发生远处转移的分子机制、寻找有效的分子靶向治疗,对于临床治疗计划的拟定具有重要的意义。EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)是果蝇zeste基因增强子的人类同源物,属PcG(Polycomb Group)基因家族的重要成员之一,定位于人染色体7q35位置上,其编码的蛋白含有高度保守的SET结构域,该结构域具有甲基转移酶的活性,通过甲基化作用抑制下游基因的表达。EZH2与细胞的生长调节有关,通过抑制染色质中的靶基因而调节细胞增殖,其高表达可导致细胞进入S期。此外,在细胞特性的维持、细胞周期的调控、细胞老化和细胞分化均起着重要的作用。越来越多的证据表明,EZH2在人类许多恶性肿瘤如口腔癌、食管癌、胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、淋巴瘤,前列腺癌和内分泌肿瘤中高表达。提示EZH2基因的异常表达与肿瘤的恶性进展和患者预后密切相关。那么EZH2与肺癌的预后是否相关呢?它在肺癌细胞中生物学行为是怎样呢?E-cadherin基因位于16q22.1位点,是钙粘附家族中的一员,主要分布在各种上皮细胞中,是调节细胞之间及细胞与细胞外基质粘附的重要媒介,对维持组织结构形态起着重要作用,被认为是一个重要的抑癌基因。最近的研究发现:EZH2可使抑癌基因E-cadherin基因启动子的H3K27甲基化,使之表达下调,促进胃癌的进展。那么二者在非小细胞肺癌组织中的表达有无相关性呢?本研究采用免疫组化结合图像分析技术,从定量和半定量的角度探讨EZH2蛋白在肺癌组织中的表达规律及与增殖、预后的关系,同时检测E-Cadherin在肺癌组织中的表达,分析EZH2和E-Cadherin在非小细胞肺癌中的相关关系,从蛋白和mRNA水平探讨EZH2在不同肺癌细胞株中的表达情况,探讨下调EZH2的表达后,E-cadherin的表达水平变化。并利用RNA干扰技术对人肺腺癌细胞株A549进行基因沉默,从细胞水平探讨EZH2对细胞形态、增殖、迁移、周期及凋亡能力的影响。目的:1.探讨EZH2在非小细胞肺癌中的表达及其及其预后意义;2.探讨EZH2与E-Cadherin在肺癌中的相关性;3.探讨EZH2下调后对肺癌细胞A549迁移、增殖、周期、凋亡能力的影响。方法:一、EZH2在正常组织、肺良性病变、非小细胞肺癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达及其预后意义的分析用免疫组织化学SP方法检测32例正常肺组织、24例肺良性病变组织、223例肺癌组织、57例对应淋巴结转移癌组织中EZH2蛋白的表达;用计算机Imageproplus图像分析软件定量测试蛋白表达的阳性单位(PositiveUint,PU)。分析不同类型肺组织中EZH2蛋白表达强度的变化规律及其表达高低水平与非小细胞肺癌临床病理特征之间的关系。在综合临床相关资料及随访资料进行统计学分析及术后生存分析。二、非小细胞肺癌中EZH2与E-Cadherin表达的相关性分析用免疫组织化学SP方法检测78例非小细胞肺癌EZH2、E-Cadherin蛋白的表达,采用半定量方法对免疫组化结果进行定量分析。半定量结果的判断方法为:根据染色程度和染色细胞所占百分比进行评分。染色程度分级:基本不着色为0分;着色呈淡黄色为1分;着色呈黄色为2分;着色呈棕褐色为3分。染色阳性细胞百分比计数,计算阳性肿瘤细胞占总肿瘤细胞的比例,将其分为5个等级:着色阳性细胞占计数细胞<5%为0分(-),5%～25%为1分(+),>25%～50%为 2 分(++),>50%～75%为 3 分(+++),>75%为 4 分(++++)。将染色程度分级与染色细胞百分比相乘,乘积≥4分为阳性表达(高表达),0～3分为阴性表达(低表达)。三、在不同人肺癌细胞株中检测EZH2的表达,及其与E-Cadherin的关系取肺癌细胞株A549、H358和GLC-82,用Western Blot方法检测A549、H358和GLC-82细胞中EZH2蛋白的表达,qRT-PCR方法检测A549、H358和GLC-82细胞中EZH2 mRNA的表达。对EZH2表达较高的一株细胞进行siRNA干扰,采用Western Blot和qRT-PCR方法验证其干扰效率,并分别检测EZH2及E-Cadherin的表达,探讨EZH2下调后是否会影响E-Cadherin的表达。四、EZH2下调对人肺腺癌细胞A549迁移、增殖、周期及凋亡的影响设计合成EZH2干扰序列,利用RNA干扰技术将其瞬时转染入人肺腺癌细胞株A549,抑制EZH2基因的表达,通过Western Blot、qRT-PCR方法检测抑制效率。MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测细胞增殖能力改变,划痕及Transwell实验检测细胞迁移运动能力变化,Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒检测凋亡的改变,细胞周期检测试剂盒检测细胞周期改变。五.统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计学分析。两样本均数间的比较采用独立样本t检验,配对样本均数间的比较采用配对样本t检验,多样本均数间的比较采用方差分析;若方差齐,组间多重比较采用LSD;若方差不齐.,组间的多重比较采用Dennett’ T3检验。非双变量正态分布资料的相关分析采用Spearman相关系数法。五年生存率的比较采用Pearsonχ2检验,采用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,差异显著性检验采用log rank检验,多因素生存分析采用Cox风险比例模型分析方法。结果:一、EZH2在正常肺组织、肺良性病变、非小细胞肺癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达在肺癌组织中EZH2的表达主要定位于肺癌细胞核,表现为粗细不等的棕褐色颗粒,其在肺良性病变及正常肺组织中几乎不表达,在支气管扩张的黏膜上皮细胞及管壁腺上皮细胞中有少量表达。非小细胞肺癌组织中EZH2的PU值高于正常肺组织和肺良性病变,差异具有统计学意义(F=92.451,P=0.000);正常肺组织与肺良性病变组织中EZH2表达的PU值差异无统计学意义(P=0.716)。支气管扩张、肺结核及肺大泡三种肺良性病变组织之间EZH2蛋白表达的PU值,差异无统计学意义(F=1.574,P=0.231)。将不同组织学类型肺癌组织中EZH2蛋白表达的PU值分别与正常肺组织和肺良性病变组织比较,差异具有统计学意义(F=35.063,P=0.000),在226例不同组织学类型的肺癌组织中,EZH2蛋白表达的PU值存在差异(F=3.38,P=0.01),鳞癌中EZH2表达的PU值分别低于腺癌、小细胞癌、腺鳞癌(P=0.010,P=0.017,P=0.048),大细胞癌中EZH2表达的PU值低于小细胞癌(P=0.044),其余各种组织学类型中EZH2表达的PU值两两比较,无显著性差异(P>0.05)。淋巴结转移灶中EZH2的表达高于原发灶,差异具有统计学意义(P=0.000)。在226例肺癌组织中,在不同分化程度的肺癌组织间,高分化肺癌中EZH2蛋白的PU值明显低于中-低分化肺癌,差异具有统计学意义(t=-4.666,P=0.000)。大体类型肺癌中,周围型肺癌EZH2蛋白的PU值高于中央型肺癌,差异具有统计学意义(t=-3.172,P=0.002)。肿瘤最大直径>3cm的肺癌组织PU值大于肿瘤最大直径≤3cm的肺癌组织(t=-2.927,P=0.004)。而肺癌组织中EZH2蛋白表达的PU值与pTNM分期、淋巴结转移、吸烟史、性别、年龄均无关(P>0.05),差异无统计学意义。二、EZH2表达与非小细胞肺癌临床病理特征预后的关系本研究中153例非小细胞肺癌患者的5年生存率为31.4%(48/153)。EZH2蛋白低表达患者的5年生存率分别为48.8%(21/43),高表达患者的5年生存率为 24.5%(27/110),差异具有统计学意义(χ2=10.826,P=0.001).Kaplan Meier分析结果显示:EZH2蛋白的表达、淋巴结转移、TNM分期、远处转移与非小细胞肺癌患者的预后相关。其中EZH2低表达患者的中位生存时间明显高于高表达患者(χ2=10.826,P=0.001);无淋巴结转移患者的中位生存时间明显高于有淋巴结转移患者(χ2=16.119,P=0.000);TNM分期为Ⅰ-Ⅱ期患者的中位生存时间明显高于Ⅲ-Ⅳ期患者(χ2=8.973,P=0.003);无远处转移患者的中位生存时间明显高于有远处转移患者(χ2=5.008,P=0.025);而年龄、性别、吸烟史、组织学类型、分化程度、大体类型、肿瘤最大直径与患者预后无明显相关。在TNMⅠ-Ⅱ期中,EZH2表达越高,患者预后越差(χ2=7.391,P=0.007),在TNMⅢ-Ⅳ期中,无论其表达高低,患者预后均较差(χ2=1.458,P=0.227);在无淋巴结转移患者中,EZH2表达越高,患者预后越差(χ2=4.879,P=0.027),在有淋巴结转移患者中,EZH2表达越高,患者预后越差(χ2=4.597,P=0.032);在无远处转移患者中,EZH2表达越高,患者预后越差(χ2=8.215,P=0.004),在有远处转移患者中,无论EZH2表达高低,患者预后均较差(χ2=1.719,P=0.190)。三、Cox风险比例模型多因素分析对所有可能影响预后的危险因素:性别、年龄、吸烟史、大体类型、肿瘤直径、组织学类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移、pTNM分期、EZH2表达分别进行单因素Cox模型分析,结果显示淋巴结转移、远处转移、pTNM分期、EZH2表达均是影响总生存期的独立预后因素(值分别是P=0.000,P=0.030,P=0.004,P=0.002),相对危险度(HR)分别为 0.449,1.847,1.801,0.464。对上述结果进一步进行多因素Cox模型分析,结果显示淋巴结转移、远处转移、EZH2表达均是影响总体生存期的独立预后因素(分别是P=0.004,P=0.027,P=0.002),相对危险度(HR)分别为0.474,1.888,0.472,即淋巴结、远处转移患者危险性高,EZH2表达高的患者危险性高。四、EZH2与E-Cadherin在肺癌组织中的表达及其相关性的分析EZH2和E-cadherin表达的相关性分析结果显示:EZH2和E-cadherin蛋白的表达,PU值呈负相关关系(r =-0.224,P = 0.048);半定量EZH2和E-cadherin蛋白的表达,二者的表达同样呈负相关关系(r =-0.232,P = 0.041),两种方法都说明EZH2和E-cadherin蛋白的表达负相关。E-cadherin蛋白定位于胞膜或胞浆,为粗细不等、弥漫分布的黄褐色颗粒。E-cadherin蛋白在鳞癌和腺癌中的表达有差异,鳞癌高于腺癌,差异具有统计学意义(P=0.035),其余组织学类型两两比较均无差异;E-cadherin蛋白的表达与性别有关,男性高于女性,差异具有统计学意义(P=0.003);E-cadherin蛋白表达与吸烟史有关,有吸烟史者高于无吸烟史者,差异具有统计学意义(P=0.005);E-cadherin蛋白表达与肿瘤最大直径有关,直径≤3cm者表达高于直径>3cm者,差异具有统计学意义(P=0.006)。E-cadherin蛋白的表达与年龄、大体类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移及pTNM分期均无关(P>0.05)。五、RNA干扰沉默EZH2基因对人肺腺癌细胞株A549的影响qRT-PCR检测三株肺癌细胞株中EZH2 mRNA的表达,结果表明:EZH2的mRNA在三株肺癌细胞株中的表达均有显著性差异(F=797.969,P=0.000);GLC-82细胞EZH2 mRNA表达最高,H358细胞表达最低。与阴性对照组相比,qRT-PCR结果显示,EZH2 SiRNA干扰48h后其相关基因E-Cadherin mRNA表达水平上调(t=-21.931,P=0.000)。Western Blot免疫印迹实验检测3株肺癌细胞中EZH2蛋白的表达,结果发现:三株肺癌细胞株的EZH2/β-actin蛋白灰度比值差异具有显著性(F=64.679,P=0.000),其中A549细胞EZH2蛋白表达最高,H358表达最低。SiRNA干扰EZH2 72h后提取细胞总蛋白,Western Blot结果显示:干扰后EZH2蛋白表达明显下调,而EZH2沉默后可以使E-Cadherin的表达上调。MTT实验结果显示:与阴性对照组相比,EZH2抑制组的A549细胞在48h、72h和96h的OD值均明显降低(P<0.05),细胞的增殖能力减弱,转染后各时间点细胞的生长抑制率分别为25.7%、20.7%、18.8%,以转染后48h最高。A549细胞划痕实验结果显示:与阴性对照组相比,EZH2抑制组在划痕后的第Oh、12h、24h、36h、48h、72h的细胞迁移速度均显著减慢。A549细胞的transwell小室实验结果显示:与阴性对照组相比,EZH2抑制组中穿过膜的细胞数目显著减少(t=4.895,P=0.000)。细胞周期实验显示,与阴性对照组相比,干扰组细胞G1期细胞增多、S期细胞减少,差异具有统计学意义(t=3.386,P=0.028;t=-4.735,P=0.009);而G2期细胞在两者中差异无显著性(t=0.434,P=0.687);结果表明SiRNA下调EZH2的表达后,可导致G1期细胞增多,S期细胞减少。AnnexinV-FITC细胞凋亡实验结果显示SiRNA下调EZH2表达后,可以导致肿瘤细胞早期凋亡比例增加,但其差异无统计学意义(t = 0.511,P = 0.636)。结论:1.EZH2表达与非小细胞肺癌组织学类型、分化程度、肺癌大体类型、肿瘤最大直径有关,与肺癌预后有关,其表达水平越高,患者的预后越差。Cox多因素回归模型分析显示EZH2表达、淋巴结转移及远处转移是影响患者生存的独立预后因素。2.EZH2和E-cadherin的表达呈负相关,下调EZH2的表达,可使E-cadherin的表达上升。3.EZH2基因可使A549细胞的增殖、迁移运动能力增强,干扰EZH2基因的表达,对周期的影响为:使G1期细胞增多,S期细胞减少,对G2期细胞及细胞凋亡无明显影响。