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第一部分抑制血脑屏障中Cx43半通道对脑缺血/再灌注损伤的影响及相关机制目的:神经血管单元(Neurovascular Unit,NVU)是脑的结构和功能单位,而其核心结构是血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)。NVU各细胞间的交流主要通过细胞连接进行,其中最主要的是连接蛋白43(Connexin 43,Cx43),参与构成缝隙连接和半通道。将Cx43作为治疗靶点,选用Cx43半通道特异性阻断剂Gap19,通过小鼠大脑中动脉闭塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)模型和细胞糖氧剥夺(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)模型进行基础研究,探讨其对脑缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤的作用及相关机制。材料与方法:1、体内实验:选用成年雄性ICR小鼠作为实验动物,随机分为假手术(sham)组、sham+Gap19组、I/R组、I/R+Gap26组和I/R+Gap19组,构建MCAO模型模拟脑缺血/再灌注损伤。缺血1小时后,分别将Gap19/Gap26(10μg)注射至不同分组小鼠侧脑室中。再灌注24小时后,对小鼠进行神经功能缺损评分,利用TTC染色测定脑梗死体积,利用Luxol Fast Blue(LFB)染色检测脑白质损伤情况。利用Western blot方法检测梗死组织中Cx43、Toll样受体4(Toll like receptor4,TLR4)及其下游通道蛋白的表达变化。2.体内实验:从不同鼠龄的小鼠中提取星形胶质细胞、脑血管内皮细胞和神经元进行原代培养,采用免疫荧光染色法鉴定细胞类型,共培养构建NVU体系并构建OGD模型。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法测定Gap19的最佳浓度。通过溴化乙锭(Ethidium bromide,EtBr)实验检测OGD后各原代细胞的半通道开放情况。利用Western blot方法检测OGD处理后Cx43、TLR4及其通道蛋白的表达变化。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测TNF-α和IL-1β。并使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)进行干预进一步验证Gap19的作用途径。结果:体内试验:与I/R组相比,Gap19处理后小鼠神经功能缺损减轻,脑梗死体积明显减少,且优于Gap26(P<0.05)。同时,结果显示Gap19组损伤侧纹状体区LFB-阳性的髓鞘密度明显地增加(P<0.05),可减轻白质损伤。Western Blot显示在缺血损伤后Cx43和TLR4的表达均增加(P<0.05),并且Gap19干预后可减少Cx43表达(P<0.05)。与I/R组相比,I/R+Gap19组TLR4通路相关蛋白MyD88、NF-κB p-p65、TNF-α及IL-1β表达水平明显减少(P<0.05)。体外实验:Gap19干预可显著提高OGD处理后的细胞活力,在浓度100μM时作用最佳(P<0.05)。通过EtBr实验发现,与control组相比,OGD处理后星形胶质细胞中可见大量半通道开放(P<0.05),而脑血管内皮细胞及神经元中染料摄取较control组无明显改变(P>0.05)。在体外实验中,Gap19也降低了Cx43、TLR4通路蛋白及炎性细胞因子的表达。免疫荧光染色显示Cx43与TLR4在OGD后的星形胶质细胞中存在共表达。Gap19可抑制LPS诱导的TLR4通路激活,降低TNF-α和IL-1β的水平。结论:Cx43半通道特异性抑制剂Gap19可通过抑制TLR4介导的信号通路对小鼠脑缺血损伤发挥神经保护作用。第二部分血脑屏障损伤相关蛋白AQP-4水平与进展性卒中的关系目的:水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP-4)是脑内表达最丰富的水通道蛋白,存在于星形胶质细胞的足突,参与构成BBB并调节水分子转运。缺血后AQP-4表达上调,增加BBB的通透性,加重脑水肿。通过检测急性缺血性卒中(Acute Ischemic Stroke,AIS)患者外周血中AQP-4水平,分析其与进展性卒中发生的相关性。材料与方法:收集2018年9月~2019年2月期间苏北人民医院神经内科发病24小时内的AIS患者,并经头颅CT或MRI确诊。于入院24小时内抽取空腹静脉血,进行ELISA实验测定血清AQP-4水平,收集AIS患者的一般临床资料。入院后NIHSS评分增加4分及以上,判定为进展性卒中。分析比较进展性卒中与非进展性卒中组患者一般临床资料和AQP-4水平,并用二分类logistic回归模型分析进展性卒中的危险因素。结果:本研究共纳入符合标准的AIS患者104例,其中39例(37.5%)为进展性卒中,65例(62.5%)为非进展性卒中。1.两组患者在低密度脂蛋白水平上差异具有统计学意义(P<0.05);2.进展性卒中组患者血清AQP-4水平(774.94±163.32pg/ml)高于非进展卒中组(408.32±133.25pg/ml),两者差异具有统计学意义(P<0.05);3.二分类Logistic回归模型分析危险因素发现,AQP-4水平升高可能是进展性脑卒中的独立危险因素。结论:AQP-4升高可能导致血脑屏障通透性增加,导致脑损伤加重,是进展性卒中的独立危险因素。