近年来,环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors, EEDs)对人类的危害日益引起公众和学术界的重视,在国际上已经成为毒理学界的研究热点。五氯酚(Pentachlorophenol, PCP)对水生生物的生长、发育和繁殖构成威胁,破坏了水生生态系统,并通过食物链进入人体,对人体健康有潜在的危害。因此在细胞水平上利用多个评价指标研究PCP对细胞的毒性效应具有重要的意义。到目前为止,PCP的内分泌干扰作用的具体机制还不清楚。雌激素受体(ER)有两种亚型：ERa和ERβ,PCP是通过ERa或ERβ其中一条途径还是通过这两条途径来行使内分泌干扰作用至今未有报道。本实验研究PCP是否通过与ERα结合来行使内分泌干扰作用,为进一步阐述PCP内分泌干扰作用的具体机制奠定基础。实验分为两大部分：第一部分：通过观察细胞形态学变化和测定细胞增殖抑制率、细胞DNA损伤以及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞培养液SOD活性变化多项评价指标研究了PCP对HeLa细胞的毒性效应。通过细胞形态学观察,初步确定在10-5 mol/L PCP开始对HeLa细胞的形态学产生影响；然后确定细胞接种的数目在6000～10000个／孔时,可以很好地反映实验结果,为后续实验奠定基础；利用MTT比色法测定PCP对HeLa细胞增殖抑制率的影响,确定了PCP半数抑制浓度IC50为66.59μmol/L,16.47μmol/L PCP染毒HeLa细胞24 h,细胞增殖抑制显著,表明线粒体已受到损伤,并且随着PCP浓度的增加,细胞增殖抑制率增大,线粒体的损伤程度愈高。应用单细胞凝胶电泳技术研究了6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L PCP染毒24 h和36 h对HeLa细胞DNA的损伤情况。实验结果表明,无论染毒24 h还是36 h,三个剂量的PCP均没有造成HeLa细胞尾部DNA百分率和尾距的显著增加,提示PCP对HeLa细胞DNA没有损伤作用。在4个染毒HeLa细胞时间下(12 h、24 h、36 h、48 h),12.5μmol/L PCP浓度的细胞LDH漏出率很低,随着PCP浓度的增加,细胞LDH漏出率逐渐增大,各PCP浓度组与12.5μmol/L PCP浓度组间均存在显著性的差异(p<0.05),200μmol/L PCP使细胞LDH漏出率达到了90%。25μmol/L的PCP已经使HeLa细胞膜受到显著性损伤,在一定的PCP浓度下(实验浓度25μmol/L PCP和50μmol/L PCP),染毒时间与HeLa细胞LDH漏出率呈现出一定的时间-效应关系。LDH漏出率是评价PCP对HeLa细胞毒性的敏感指标之一。实验研究发现12.25μmol/L、17.5μmol/L和25μmol/L PCP浓度组与溶剂对照组相比,细胞培养液SOD活性存在显著性差异(p<0.05),并且随着PCP浓度的增加SOD活性逐渐下降,存在一定的浓度-效应关系。HeLa细胞的4个染毒时间的细胞培养液SOD活性具有显著性差异(p<0.05),具有一定的时间-效应关系。相比细胞LDH漏出率,细胞培养液SOD活性是评价PCP对HeLa细胞毒性的更敏感指标。第二部分：通过建立的hERa细胞筛选系统,初步研究发现PCP是一种具有弱雌激素活性的内分泌干扰物,PCP可以通过ERa结合形成配体-受体复合物,发生构象改变并同型二聚体化,同型二聚体化的复合物可以和DNA分子上的雌激素反应元件(ERE)结合,激活受ERE调控的荧光素酶基因,荧光素酶基因转录形成mRNA, mRNA进一步翻译为荧光素酶(Luciferase, Luc),通过测定荧光素酶活性可以间接反映PCP的内分泌干扰作用。PCP可以和17口-乙炔雌二醇(17β-ethinylestradiol, EE2)竞争结合ERα, PCP浓度越大竞争结合ERa的能力越强,同时与EE2共同诱导Luc表达的水平降低。本实验结果表明：PCP染毒HeLa细胞,可以改变细胞形态,10-4 mol/L PCP造成绝大部分的HeLa细胞死亡；PCP对HeLa细胞的半数抑制浓度ICso为66.59μmol/L,16.47μmol/L PCP已经引起线粒体损伤；PCP对HeLa细胞DNA没有损伤作用；细胞LDH漏出率、细胞培养液SOD活性均是评价PCP对HeLa细胞毒性的敏感指标；PCP是一种具有弱雌激素活性的内分泌干扰物,PCP可以通过结合ERa行使内分泌干扰作用。