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骨关节炎（OA）是一种以关节软骨的退行性病变和继发性骨质增生为主的常见慢性关节疾病,在世界各地有数以百万计的人患有关节炎。关节腔注射药物分子可以有效减缓或阻止OA的病程进展,但是关节腔内注射的小分子或生物大分子会被滑膜下的淋巴系统快速清除,同时致密的关节软骨细胞外基质阻碍药物分子的进入,这些都限制了OA治疗药物的研究应用。因此,本研究拟构建新型的关节腔注射递送系统用于OA的治疗,尤其是用于关节软骨损伤的修复以及软骨内靶向和滞留。本课题分为两部分,第一部分是设计一个“Nano in Gel”的复合系统,即温敏凝胶负载KGN纳米粒双重缓释递送系统,用于体内软骨损伤修复的研究。首先,构建基于聚酰胺-胺树状大分子（PAMAM）的Kartogenin（KGN）递送系统。KGN是一种小分子化合物,它可以促使间充质干细胞（MSCs）向软骨细胞分化。将KGN与PAMAM相连,制备三种载药方式不同的PAMAM-KGN纳米粒,研究和比较PAMAM-KGN纳米粒诱导MSCs向软骨细胞分化的能力并对其作用机制进行初步探讨;然后将优化的PAMAM-KGN纳米粒与温敏水凝胶相结合形成长效缓释复合系统,关节腔注射该复合系统可以归巢滑膜以及骨髓来源的间充质干细胞于水凝胶支架上并通过KGN纳米粒诱导其向软骨方向分化来修复损伤软骨。第二部分是结合软骨结构的特殊性,软骨是由软骨细胞和丰富的软骨细胞外基质（ECM）组成,ECM是一个带有负电荷的具有60 nm孔隙的富含透明质酸的致密3D网状结构。以正电荷的PAMAM作为基础载体,通过静电作用结合ECM,引入软骨亲和肽（CAP）增强软骨靶向性,构建关节软骨内靶向递送系统,以期实现骨关节炎治疗基团在软骨内的高效转运。第一部分温敏凝胶负载KGN纳米粒缓释系统诱导MSCs分化修复软骨损伤的研究以邻苯二甲酸酐和4-胺基联苯为起始原料,通过一步法合成小分子化合物KGN。通过1H NMR、13C NMR、FTIR和MS对KGN进行结构确认和表征,同时测定KGN的溶解特性和油水分配系数,结果表明KGN可以初步确定为低溶解度、高透过性的药物。接着将KGN与PEG化的PAMAM相连,制备三种不同载药方式的PAMAM-KGN纳米粒,分别为物理包埋组PEG-PAMAM/KGN（PP/K）,化学键合组PEG-PAMAM-KGN（PPK）和KGN-PEG-PAMAM（KPP）。三种纳米粒PEG偶联个数相近,约为20个;平均粒径在3040 nm之间,分布均匀,球形或类球形;Zeta电位+5 mV左右;载药量在5.2-5.5%（wt.%）之间。采用全骨髓贴壁法获得性状稳定、生长活跃的骨髓MSCs（BMSCs）。MTT实验证明PAMAM-KGN纳米粒不影响BMSCs的正常生长。采用流式细胞术考察RAW264.7巨噬细胞对载体的摄取情况,结果表明PEG化的PAMAM递送系统增强了对抗巨噬细胞吞噬的能力。在体外诱导BMSCs分化成软骨细胞实验中,KGN和PAMAM-KGN纳米粒均可诱导BMSCs向软骨细胞分化,其中KPP纳米粒组软骨相关蛋白和mRNA表达水平量最高,提示KPP诱导软骨分化能力最强。通过流式细胞仪和共聚焦显微镜考察纳米载体的摄取、摄取机制和胞内分布情况,结果表明递送载体PEG-PAMAM在BMSCs上的摄取速度快,是一个消耗能量的内吞过程,主要通过小窝蛋白介导的内吞途径入胞,摄取后的载体只有部分分布于溶酶体,并且能够很快从溶酶体逃逸进入细胞质。进入细胞质的KGN和PAMAM-KGN纳米粒会竞争性结合细胞内的信号分子,诱导成软骨分化,其中,KPP组竞争性结合能力最强。通过开环聚合反应合成PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物,采用1H NMR、FTIR和GPC对其结构进行确认。考察共聚物溶液的理化性质,制备温度敏感水凝胶负载KPP纳米粒的复合递送系统（“Nano in Gel”）。结果表明浓度20 wt.%的温敏凝胶复合物相转变温度为29℃,常温下流动性、通针性好,可用于关节腔注射。体外释放实验结果显示温敏凝胶对KGN和KPP纳米粒的释放时间长达27 d,起到了对药物的缓释作用。通过体内实验评价温敏凝胶负载KPP纳米粒诱导体内MSCs分化修复损伤软骨的能力。通过体外BMSCs细胞增殖实验,皮下和关节腔内注射纳米粒凝胶复合物初步评价其生物安全性,结果表明复合物生物相容性较好。活体成像结果显示纳米给药系统结合温敏凝胶延长了药物在大鼠膝OA关节腔内的滞留时间,从而有助于药效的发挥。经膝关节腔注射木瓜蛋白酶诱导大鼠OA模型后,关节腔注射KGN递送系统可诱导MSCs向软骨表型分化来修复损伤的软骨。软骨大体和组织切片观察结果显示,温敏凝胶负载KPP纳米粒组（KPP/Gel）形成了组织结构和功能与正常软骨最为接近的组织工程化软骨。第二部分软骨亲和肽修饰PAMAM递送系统构建及其软骨内靶向和滞留作用研究首先通过流式细胞术筛选在软骨细胞上具有较高摄取效率的软骨亲和肽（CAP）;然后通过双功能的Mal-PEG-NHS分别偶联靶向头基CAP和载体PAMAM,为了便于细胞内的示踪和生物学评价,同时将罗丹明B异硫氰酸酯（RBITC）键合到PAMAM表面,最后通过控制CAP/PAMAM投料摩尔比,制备一系列CAP偶联数目不同的CAP-PEG-PAMAM-RB（CAP-PP-RB）聚合物,分别为CAP4-PP-RB、CAP8-PP-RB和CAP16-PP-RB。通过1H NMR峰面积计算得到每个PEG-PAMAM上平均共价结合了3.7、6.6和12.4个CAP。CAP-PP-RB聚合物粒径在50-60 nm之间,Zeta电位+4.5-+5.5 mV。细胞摄取实验结果表明随CAP修饰比例的升高细胞摄取量反而减少,故选择CAP4-PP-RB用于进一步评价CAP修饰对体内外软骨靶向的影响。通过流式细胞仪和共聚焦显微镜考察CAP4-PP-RB和PP-RB的摄取、摄取机制、胞内分布以及对体外软骨球的穿透能力。结果表明CAP-PP-RB和PP-RB聚合物在软骨细胞上的摄取是一个时间、剂量依赖且耗能的动态过程,主要通过网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞入胞,摄取后的聚合物分布于溶酶体。CAP肽的偶联增强了聚合物向软骨三维球内部渗透的速率和强度。活体成像结果显示,与游离的Cy7组相比,纳米载体组在大鼠膝关节内的滞留时间均延长,可达21 d;纳米载体在关节内的生物相容性较好,没有引起明显的软骨损伤和滑膜炎症;体内软骨靶向和穿透实验结果表明CAP肽的修饰可以协助阳离子的纳米载体进入软骨,甚至软骨细胞内。