论文部分内容阅读
目的:（1）探究α-常春藤皂苷（α-Hederin）对人肝癌Bel-7402细胞的增殖及细胞内抗氧化体系的影响;（2）探讨α-常春藤皂苷是否通过铁死亡（ferroptosis）途径来抑制Bel-7402细胞的增殖并研究α-常春藤皂苷诱导Bel-7402细胞铁死亡的机制。方法:（1）α-常春藤皂苷对肝癌Bel-7402细胞增殖和抗氧化体系的影响:MTT法检测梯度浓度的α-常春藤皂苷（0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100μmol/L）处理Bel-7402细胞24 h后细胞的活力情况,计算α-常春藤皂苷对Bel-7402细胞的半数抑制浓度(IC50);将Bel-7402细胞分为空白对照组、α-常春藤皂苷（25μmol/L）组和α-常春藤皂苷（50μmol/L）组,谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒测定分组后细胞内GSH含量。（2）Western blot法检测胱氨酸-谷氨酸的反向转运体亚基x CT、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、二价金属转运蛋白1（DMT1）三个铁死亡关键蛋白的表达水平;活性氧（ROS）检测试剂盒检测细胞ROS水平;丙二醛（MDA）检测试剂盒检测细胞内MDA含量;MTT法检测不同浓度的铁死亡抑制剂ferrostatin-1（0,2,5,10μmol/L）和α-常春藤皂苷（40μmol/L）联合干预Bel-7402细胞24 h后细胞的活力情况;根据MTT实验检测结果选择适合浓度的ferrostatin-1进行铁死亡的恢复实验,分为空白组、α-常春藤皂苷（40μmol/L）组、α-常春藤皂苷（40μmol/L）+ferrostatin-1（5μmol/L）联合用药组,比较加入了铁死亡抑制剂后细胞的功能恢复情况。检测各组细胞的GSH水平、铁死亡相关蛋白表达水平、ROS水平和MDA水平,进行分析。结果:（1）α-常春藤皂苷能够抑制Bel-7402细胞增殖且抑制效应随着药物浓度的增加而增强,24 h对应的IC50值为40.32μmol/L;α-常春藤皂苷处理Bel-7402细胞24 h后,低、高剂量药物组细胞内GSH含量分别有不同程度的降低,与空白组相比其差异显著（P＜0.01或P＜0.001）,GSH含量的明显下降破坏了细胞内的抗氧化体系,为细胞发生铁死亡提供了重要条件。（2）α-常春藤皂苷处理Bel-7402细胞24 h后,Western blot结果证明用药组x CT蛋白表达下调（P＜0.01或P＜0.001）、GPX4蛋白表达下调（P＜0.05或P＜0.001）、DMT1蛋白表达上调（P＜0.01或P＜0.001）。以上表明α-常春藤皂苷发挥诱导Bel-7402细胞铁死亡的作用时,抑制x CT、GPX4的表达,促进DMT1的表达;ROS检测结果表明细胞内ROS水平随着α-常春藤皂苷的浓度增加而升高,使用α-常春藤皂苷后细胞内产生了大量的ROS;MDA检测结果表明低、高剂量组细胞内MDA含量分别有不同程度的升高,与空白组相比其差异具有显著性（P＜0.05或P＜0.01）;MTT法检测结果表明加入不同浓度铁死亡抑制剂ferrostatin-1后,能够抑制α-常春藤皂苷造成的细胞活力下降。ferrostatin-1（2μmol/L）+α-常春藤皂苷（40μmol/L）组相比α-常春藤皂苷（40μmol/L）组,细胞活力增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）,发现使用5μmol/L的ferrostatin-1具有非常好的抑制效应,因此选择5μmol/L的ferrostatin-1进行下一步实验。实验结果表明,ferrostatin-1（5μmol/L）+α-常春藤皂苷（40μmol/L）组相比α-常春藤皂苷（40μmol/L）组GSH含量显著增多（P＜0.001）,蛋白x CT、GPX4表达上调,DMT1表达下调,抑制了铁死亡途径,ROS水平降低,MDA水平降低（P＜0.01）,细胞内脂质过氧化水平下降。结论:（1）α-常春藤皂苷可抑制Bel-7402细胞增殖并破坏细胞内的抗氧化体系;（2）α-常春藤皂苷可通过铁死亡途径抑制Bel-7402细胞增殖。α-常春藤皂苷通过抑制x CT的表达,降低细胞内GSH水平,造成GPX4表达下调,抗氧化体系进一步被破坏。DMT1表达上调转运更多的Fe2+发生芬顿反应,大量脂质ROS生成而抗氧化体系功能失调,导致肝癌Bel-7402细胞铁死亡。