褐藻胶裂解酶是一类海藻工具酶,其研究与应用已成为海洋生物功能资源开发与利用的重要内容。根据底物专一性的不同,褐藻胶裂解酶分为多聚甘露糖醛酸裂解酶和多聚古洛糖醛酸裂解酶。褐藻胶裂解酶系就是由这两类酶或与兼具这两类酶特性的酶共同组成的酶系。本文以实验室现有的胞外褐藻胶裂解酶系高产菌株HZJ216为研究对象,对其所产酶系进行酶化学、产物分析和应用研究,并应用分子动力学模拟方法初步探讨溶剂环境下该类酶与底物之间的相互作用。这是首次对海洋微生物来源的褐藻胶裂解酶系的研究,主要研究结果如下:　　 对实验菌株HZJ216的分子生物学和生理生化鉴定结果表明它与Pseudomonas fluorescens相似性最高,因此命名为Pseudomonas fluorescensHZJ216。该菌株发酵上清液酶活力达975 EU mL-1。对其分离纯化获得分子量分别为60.25、36和23 kDa的褐藻胶裂解酶(依次命名为褐藻胶裂解酶A、B和C)组成的酶系,其等电点分别为4、4.36和4.59。对酶的N端序列分析表明,褐藻胶裂解酶A和C为新酶。三种酶的最适pH值均为7.0,最适反应温度均为35℃,酶A相对于酶B和C表现更高的热稳定性。Na+、K+和Mg2+可不同程度地提高三种酶的活力。初步判断酶A兼具pM和pG特异性,而酶B和C则分别表现pM和pG特异性,证明了酶系不同组分的底物专一性。　　 初步探讨了该类酶的构效关系和催化机理。对褐藻胶裂解酶Al-Ⅱ的环L1和L2构成的活性中心开放(2CWS)和关闭(2ZA2)结构的比较研究发现,L1相对于L2的移动构成酶活中心的开闭状态,L1在酶活性状态调节中起关键作用。一个新发现的L3环对底物识别可能起到重要调节作用。用分子动力学模拟方法研究2CWS环区变化发现,酶活中心从关闭到开放状态,能量变化7.08kcal/mol,而氢键的键能一般为3-7kcal/mol,表明氢键是维持该酶环区关闭及酶失活的关键因素。通过QM/MM分子动力学模拟方法对酶A1-Ⅱ与底物复合物晶体结构(2ZAA)的模拟计算,获得了酶催化反应的中间过渡态结构,并证实Tyr284的催化酸作用。　　 利用该酶系酶解褐藻胶进行终产物分析研究。经pH和有机溶剂沉淀获得两组酶解终产物,用阴离子交换色谱分离纯化共获得六个单一聚合度的不饱和低聚糖组分。应用ESI-MS确定各组分分子量,利用2D NMR鉴定其结构,确定它们分别为非还原端含双键并以甘露糖醛酸为还原端的DM、DMM、DGM和以古洛糖醛酸为还原端的DG、DGG、DMG。这是首次在酶解终产物中获得全部种类的不饱和褐藻二糖和三糖,同时也证明了组成该酶系的各酶的不同底物专一性。　　 由于该酶系具有稳定与高效的特点,适于酶制剂生产开发,因此对酶制剂的制备和基本性质进行了系列研究,结果表明:以酶活力为975 EU mL-1、比活力为3034 U mg-1的发酵液出发,用盐析和有机溶剂沉淀两种方法制备固体粗酶制剂,其酶活力达60万单位/g。-20℃下保存一年内,有机溶剂沉淀制备的固体酶活力保留85％,盐析制备的固体酶活力保留90％。该酶制剂产品符合FAO和WHO规定的通用质量标准。　　 利用该酶系为工具酶可制各低粘度和超低粘度褐藻胶。以10 g干海带制备300 mL消化液为例,加入0.1～0.75 mL(975 EU mL-1)酶液可获得低粘度褐藻胶(100～200 mPa·s),同传统工艺相比,产品收率提高1～7％,节水率为10～40％;加入0.75～2 mL(975 EU mL-1)酶液,可获得超低粘度褐藻胶(10-100 mPa·s),同传统工艺相比,产品收率提高7～15％,节水率达40～50％。　　 本课题对一株能稳定高效产褐藻胶裂解酶系的菌株从菌种、酶学性质、产物分析及应用等方面进行了系统的研究,证实了组成酶系各酶的不同底物专一性,获得了全部种类的褐藻二糖和三糖产物,制得高效稳定的酶制剂产品,利用该酶系获得新的褐藻胶产品制备的酶控工艺,并首次利用分子动力学方法探讨了该类酶的催化机理。这些研究为以该酶系为整体的新型海洋工具酶的应用、新酶制剂及褐藻胶新产品开发等提供了重要的理论基础和应用价值。