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第一部分ATRQβ-001疫苗对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠有效性研究目的：前期工作中我们研制出一种针对人血管紧张素Ⅱ受体1型的短肽治疗性疫苗ATRQβ-001,本研究旨在验证ATRQβ-001疫苗在糖尿病肾病模型老鼠上是否有效,以链脲佐菌素(STZ)腹腔注射方法建立糖尿病肾病模型。方法：将ATR-001短肽与Qp-2aa病毒样颗粒(VLP)用化学耦联剂Sulfo-SMCC耦联制备ATRQβ-001疫苗。Sprague Dawley大鼠随机分为对照组和糖尿病组,糖尿病组用链脲佐菌素(60mg/kg)腹腔注射,1周后,模型组又随机分为4组,每组15只老鼠：(1)糖尿病肾病(DN)组：等剂量皮下注射生理盐水干预；(2)奥美沙坦(OM)组：按5mg/kg/d给予灌胃；(3) ATRQP-001组：将ATRQβ-001疫苗与氢氧化铝佐剂乳化后,按400μg/只于第0、14、21天皮下多点免疫；(4) Qβ VLP (VLP)组：将QβVLP与氢氧化铝佐剂乳化,按4001μg/只于第0、14、21天皮下多点免疫。干预后继续观察14周。所有大鼠每周称量体重,监测血糖,每两周测定ATR-001特异性抗体滴度,每四周测定血压,于第4、8、14周代谢笼测定老鼠尿量及24小时尿蛋白量。饲养结束后,检测血肌酐、尿素氮水平和肾脏病理结构改变。结果：ATRQP-001疫苗可产生较高滴度抗ATR-001抗体,并可有效降低糖尿病老鼠的血压水平,最高降幅达19.4mmHg。疫苗免疫后不影响血糖血脂水平,但可降低24小时尿蛋白量、血肌酐、尿素氮水平,并减轻肾体比,逆转nephrin、podocin表达下降,减轻足细胞损伤和系膜扩张,且与奥美沙坦治疗组无明显统计学差异。结论：ATRQβ-001疫苗可有效改善链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病模型大鼠的肾功能和血压水平,并减轻肾脏病理损害,与奥美沙坦治疗组无明显差异。第二部分ATRQP-001疫苗肾脏保护机制研究目的：本研究旨在探讨ATRQβ-001疫苗的作用机制,主要从炎症纤维化和对RAS系统的调控两方面研究,并在体外用抗ATR-001抗体在大鼠肾脏系膜细胞系上进一步评价。方法：检测血浆中肾素活性(PRA)、血管紧张素(Ang)Ⅱ、Ang (1-7)、肾脏皮质AngⅡ和Ang(1-7)含量,其中PRA和Ang Ⅱ用放射免疫分析方法检测,Ang(1-7)用高压液相色谱技术检测。Masson三色染色观察肾脏纤维化,免疫组化检测肾脏TGF-β1表达和单核巨噬细胞浸润情况,蛋白免疫印迹(western blot)检测RAS相关蛋白表达和ERK1/2、p38 MAPK磷酸化水平,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测RAS成分、促炎细胞因子和促纤维化生长因子mRNA表达水平。体外实验评估抗ATR-001抗体(Anti-ATR-001)对高糖诱导的大鼠肾脏系膜细胞影响,western blot检测TGF-β1和磷酸化ERK、Smad3水平,qRT-PCR检测TGF-β1、胶原蛋白(Collagen)Ⅳ和纤连蛋白(Fibronectin)表达。结果：与奥美沙坦相比,ATRQβ-001疫苗并不增加循环中PRA和Ang Ⅱ浓度,二者均可降低肾脏组织中下调肾脏Ang Ⅱ浓度,并增加Ang(1-7)含量,抑制肾脏局部ACE-AngⅡ-ATIR轴表达,上调ACE2-Ang (1-7)-mas轴。ATRQβ-001疫苗可有效减轻肾脏间质纤维化水平,并减少肾小球和间质巨噬细胞浸润数目,TGF-β1的表达和活性氧产生亦明显减少。肾脏组织炎性细胞因子和促纤维生长因子mRNA表达也在经ATRQp-001疫苗和奥美沙坦治疗后有所下降,且与两组之间无统计学差异。体外实验中Anti-ATR-001可有效抑制高糖刺激下肾脏系膜细胞(RMCs) TGF-β1表达和Smad3磷酸化水平,其下游Collagen IV和Fibronectin的表达亦下调结论：ATRQβ-001疫苗主要通过调控RAS双轴和抑制炎症纤维化两方面起到肾脏保护作用。第三部分ATRQβ-001疫苗的安全性研究目的：ATRQβ-001疫苗可减轻STZ诱导的糖尿病肾病模型大鼠肾脏病理损害,将进一步在Sprague Dawley (SD)大鼠上观察疫苗的安全性。方法：将ATR-001短肽与Qβ-2aa病毒样颗粒(VLP)用化学耦联剂Sulfo-SMCC耦联制备ATRQp-001疫苗。Sprague Dawley大鼠随机分为对照组和ATRQβ-001疫苗组,每组10只老鼠,疫苗组按400μg/只于第0、14、21天皮下多点免疫,对照组给予等剂量皮下注射生理盐水。每两周测定抗ATR-001特异性抗体滴度,每四周测定血压。在长达150天的观察期后,ELISA方法检测血清中C3a和C5a含量,并取心脏、肺组织、肾脏、肝脏、脾脏,进行HE染色和CD14、CD19免疫组化染色,观察各组织脏器有无明显炎症反应及炎性细胞浸润情况,取肾脏组织再进行Masson三色、PAS染色和电镜检测,确定有无免疫介导的肾脏病理损害。结果：ATRQβ-001疫苗可产生较高滴度抗ATR-001抗体,对正常老鼠血压水平无影响。血清中C3a和C5a含量与对照组无明显差异。HE染色显示疫苗组各组织未见明显炎症反应,CD14、CD19免疫组化染色亦未见单核细胞和B细胞浸润,肾脏组织未见系膜扩张、间质纤维化等病变,电镜下足突无融合消失,肾小球系膜区无增生,基底膜无增厚,且未见明显免疫复合物沉积。结论：ATRQβ-001疫苗不降低正常老鼠血压,未产生明显免疫介导的组织病理损害,安全性良好。