肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是恶性程度最高的肿瘤之一,在世界范围内发病率居所有肿瘤的第五位,病死率居第三位,全世界每年新发病例100万,严重危害人类健康和生命。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是HCC发生的主要危险因素,临床研究报道63.2%的肝癌患者乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)日性。尤其是我国,HBV感染人数居世界首位,HCC病例数约占全球的55%。探讨HBV相关HCC分子发病机制,为HCC的诊断和治疗提供新靶点,具有重要意义。HBV相关HCC发生机制极为复杂,HBV所编码蛋白的多功能性是其中的重要机制。大量研究表明HBV及其编码蛋白对宿主多种基因,尤其是肿瘤相关基因的转录调控,在HBV致癌过程中发挥重要作用。因此,研究HBV各编码蛋白对宿主基因的调控,寻找受HBV调控的宿主关键基因,并进一步阐明其分子机制,不仅有助于揭示HBV致癌的复杂机制,还将为HCC诊断或治疗提供新切入点。本实验室长期从事HBV与宿主相互作用及HCC致病机制研究,前期研究发现,X基因编码的X蛋白(HBx)、preS2/S编码的羧基末端截短的截短型中蛋白(MHBst)及C基因编码的核心蛋白(HBc)均可以调控宿主关键基因表达,在HBV相关HCC发生中发挥重要作用。众多研究表明,多种免疫调节分子在HBV感染所致淋巴细胞功能失调中发挥着重要作用。叉头样转录因子3(transcription factor forkhead box protein3, FOXP3)和T细胞免疫球蛋白粘蛋白样蛋白-3(T cell immunoglobulin—and mucin-domain-containing molecule3, TIM-3)是近年发现的两种重要免疫调节分子,不仅调节免疫应答,而且参与多种疾病的发生。本实验室前期工作及文献研究表明,慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者外周血单个核细胞上FOXP3及TIM-3表达显著升高,且HBV介导NK细胞高表达TIM-3是CHB患者NK细胞功能抑制重要机制,提示HBV调控免疫分子FOXP3及TIM-3表达在HBV相关疾病发生中具有重要意义。因此,本课题拟深入研究HBV对免疫调节分子F0XP3及TIM-3的调控作用及其在HCC发生中的生物学意义。本研究将分两部分：第一部分HBV对F0XP3的表达调控及其生物学意义第二部分HBV对TIM-3的表达调控第一部分HBV对FOXP3的表达调控及其生物学意义F0XP3是叉头样转录因子家族中的一员,2003年被定义为CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)的特异性标志,在Treg发育和功能发挥中起至关重要的作用。大量研究证实FOXP3在多种肿瘤患者外周血淋巴细胞及肿瘤浸润淋巴细胞中高表达,FOXP3+Treg细胞在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。然而,新近研究发现,FOXP3可以在多种非淋巴来源的肿瘤细胞表达,并在肿瘤发生中发挥作用,但其功能却存在明显的肿瘤特异性。乳腺和前列腺上皮细胞中,FOXP3抑制癌基因表达发挥抑癌基因的作用,其突变或表达下调导致乳腺癌及前列腺癌发生；相反,在黑色素瘤和胰腺癌中,肿瘤细胞高表达FOXP3,可增强肿瘤细胞对CD4+T细胞增殖的抑制作用,提示FOXP3参与肿瘤细胞免疫逃逸。FOXP3在肿瘤细胞的表达及其作用的复杂性强烈提示有必要深入研究FOXP3在不同肿瘤细胞中的表达及作用。FOXP3作为Treg细胞标记参与HBV相关HCC发生的作用已被广泛证明。临床研究表明,CHB及肝癌患者外周血单个核细胞及局部组织中浸润的FOXP3+Treg细胞数量明显升高,且与病毒滴度呈正相关,多因素分析表明FOXP3+Treg细胞的浸润可作为潜在的HCC预后指标。但HBV是否可以调控FOXP3表达,肝癌细胞中是否表达FOXP3,其生物学作用如何,迄今尚未阐明。综上,为了深入探讨HBV相关HCC的发病机制,本研究选择FOXP3作为HCC发生的关键基因,深入研究HBV对FOXP3的表达调控及肝癌细胞表达的FOXP3在HCC发生中的生物学作用,以期为寻找HCC治疗新靶点提供理论基础。研究目的：1.研究F0XP3在不同细胞中的表达及其表达模式；2.明确HBV及其编码蛋白对FOXP3的调控作用,并阐明其转录调控机制；3.初步探讨FOXP3对肝癌细胞生物学活性的影响。研究方法：1FOXP3在不同细胞中的表达及其表达模式1.1免疫组织化学1.1.1石蜡切片：收集10例HCC组织标本及癌旁组织,石蜡包埋、切片。所有病人均为HBsAg (+)患者,术前未经抗病毒治疗,无HIV感染和过量饮酒史。根据Edmondson and Steiner进行肿瘤分级。免疫组化检测组织切片中FOXP3表达情况。1.1.2组织芯片：选取180点肝癌组织/癌旁组织芯片,免疫组化检测FOXP3表达,分别对胞浆胞核中的FOXP3染色强度和细胞数进行评分,利用Fisher’s exact检验与年龄、分级、TNM分期、HBV等多项临床指标之间的相关性。1.2Western-blot1.2.1HCC临床组织标本：收集4例HCC组织标本,手术视野下取肿瘤及瘤旁组织,-80℃冻存备用。抽提组织总蛋白,western-blot检测FOXP3蛋白表达水平。1.2.2细胞系：收集永生化肝细胞L02及6株肝癌细胞系,常规方法培养,细胞贴壁后24～48h达对数生长期后,抽提总蛋白,western-blot检测FOXP3蛋白表达水平。1.3RT-PCR:抽提上述细胞系总RNA, RT-PCR检测FOXP3在mRNA表达水平。1.4免疫荧光：常规方法培养乳腺癌细胞系MCF-7、前列腺癌细胞系PC3和肝癌细胞系HepG2,细胞爬片达对数生长期,多聚甲醛固定,利用FOXP3抗体及荧光二抗免疫荧光染色,DAPI复染细胞核,激光共聚焦显微镜下观察。2HBV及其编码蛋白对FOXP3表达的调控作用及其转录调控机制研究2.1比较CHB患者HBV(+)及HBV(-)外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中FOXP3表达：收集60例CHB患者外周血,淋巴细胞分离管分离PBMC,提取病毒DNA, PCR检测HBV-DNA表达,将病例分为HBV-DNA阳性组和阴性组,抽提细胞总RNA和蛋白,RT-PCR、实时荧光定量PCR、western-blot检测FOXP3表达,分析FOXP3在两组标本中的表达差异。2.2基因转染及反义封闭实验：利用脂质体分别将HBV及其编码蛋白HBx/preS2/HBc表达载体转染HBV阴性的肝癌细胞系HepG2及Be17402,48h后收集细胞,抽提总RNA及蛋白,RT-PCR、western-blot检测FOXP3表达,研究HBV及其编码蛋白过表达对肝癌细胞系内FOXP3表达的影响；设计合成分别针对HBx/preS2/HBc的反义寡核苷酸(antisense ologonucleotides, asons),脂质体转染整合有HBV DNA的肝癌细胞系HepG2.2.15细胞,RT-PCR、western blot检测FOXP3表达,研究反义封闭HBV编码蛋白对肝癌细胞内FOXP3表达的影响。为验证基因过表达及反义封闭效果,同时RT-PCR检测HBV各基因表达。2.3系列截短及突变的FOXP3启动子报告质粒的构建：FOXP3启动子报告质粒由瑞士实验室Dr.Mannel惠赠。以pGL4.10-465/176为模板,设计引物,构建-465～-383bp之间20bp递减截短启动子报告载体；设计引物,在-464bp、-383bp、-328bp位点上引入突变,构建转录元件AP-1、NF-AT突变的FOXP3启动子报告质粒。2.4双荧光素酶报告基因检测：脂质体法将1μg FOXP3系列截短启动子报告质粒与1/40ng pRL-TK质粒(内参)转染入肝癌细胞系HepG2和Be17402,48h后收获细胞蛋白,双荧光素酶报告基因检测分析启动子活性；HBV及其编码蛋白HBx/preS2/HBc表达载体分别与FOXP3核心、突变或截短启动子共转染肝癌细胞系HepG2和Be17402(同时转染及1/40ng pRL-TK作为内参对照),双荧光素酶报告基因检测研究HBV及其编码蛋白对FOXP3启动子的调控；利用针对HBx/preS2/HBc的asons封闭HepG2.2.15中HBV表达,同时转染FOXP3启动子报告质粒,同上进行双荧光素酶报告基因检测；不同剂量的HBV及其编码片段表达载体或asons分别与pGL-465/176共转染HepG2、Be17402或Hep2.2.15研究HBV反式激活FOXP3启动子pGL-465/176的剂量依赖性。2.5凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA):脂质体转染HBx表达载体pcDNA3-HBx-HA (pcDNA3空载体为对照)入肝癌细胞HepG2,48h后提取核蛋白,BCA法测定蛋白浓度。合成20bp(-465～-445bp)寡核苷酸片段probe和AP-1位点突变的寡核苷酸片段mut-probe,同时购买商品化AP-1特异性结合序列或结合位点突变序列,地高辛标记后作为探针,未标记的过量冷探针作为特异竞争,无关序列探针作为非特异性竞争,与上述细胞核蛋白共孵育后,EMSA检测核蛋白与上述探针的结合情况,同时在上述体系中加入HA抗体进行supershift实验。2.6Si-RNA封闭实验：脂质体法将pcDNA3-HBx-HA和针对c-JUN的si-RNA(无关序列si-control为对照组)共转染入肝癌细胞HepG2,48h后分别抽提总RNA和总蛋白,RT-PCR、western-blot检测FOXP3表达。为验证si-RNA的封闭效果,western-blot检测两组c-JUN的表达水平。3FOXP3对肝癌细胞生物学活性影响的初步研究。3.1细胞生长曲线：利用脂质体转染技术在FOXP3低表达肝癌细胞系HepG2中转染FOXP3表达载体pCI-hFOXP3,在FOXP3高表达肝癌细胞系HepG2.2.15中转染si-RNA (si-FOXP3)封闭FOXP3,12h后以104个/孔种96孔板,利用CCK-8检测7天内细胞增殖能力。PcDNA3-HBx-HA与si-FOXP3共转染HepG2细胞(pcDNA3和si-control设为对照),CCK-8检测6天内细胞增殖能力；同时在转染后1、2、4、5天抽提总蛋白,western-blot检测FOXP3表达水平。3.2集落形成实验：同上利用基因转染技术建立FOXP3过表达或封闭肝癌细胞模型,转染12h后以5000、104、2×104个/孔种6孔板,6天后除去培养基,结晶紫染色,显微镜下观察,>50个细胞为一个集落。3.3细胞周期检测：同上建立FOXP3过表达或封闭肝癌细胞模型,转染48h后PI染色,流式细胞术检测细胞周期。为进一步研究FOXP3影响细胞周期的机制,RT-PCR、 western-blot检测两组细胞内细胞周期蛋白的表达变化。3.4磁珠分选CD4+T细胞,与FOXP3过表达肝癌细胞共培养：分离健康人PBMC,磁珠分选CD4+T细胞；pCI-hFOXP3转染肝癌细胞系HepG2,24h后与经CD3/CD28抗体预刺激且CFSE染色的CD4+T细胞共培养3天,流式细胞术检测T细胞增殖情况。研究结果：1FOXP3在肝癌细胞等多种细胞中表达并呈现不同表达模式1.1FOXP3在永生化肝细胞系及肝癌细胞系中均有表达RT-PCR及western-blot检测结果显示,7株肝来源细胞系中均有不同水平FOXP3表达,其中,永生化肝细胞L02中FOXP3表达较低,而整合有4copies HBV DNA的肝癌细胞系HepG2.2.15中FOXP3表达水平最高。1.2肝癌临床标本检测发现,FOXP3不仅表达于浸润淋巴细胞,且在肝癌细胞及其它细胞中表达为研究FOXP3在肝癌组织中的表达,本研究收集4例HCC患者癌及癌旁组织,western-blot检测结果显示,FOXP3在肝癌及癌旁组织中均有表达,且4对标本中,肝癌组织内FOXP3表达明显高于癌旁对照。为进一步研究FOXP3在肝癌组织中的表达模式,本研究收集了10例HCC患者癌及癌旁组织标本,免疫组化检测结果显示,FOXP3阳性染色可见于浸润淋巴细胞、库弗氏细胞(Kupffer’s cell)、肝细胞及小胆管上皮细胞。低分化肿瘤细胞胞浆呈FOXP3强阳性,高分化肿瘤细胞则胞浆胞核均有FOXP3中等或弱表达,而癌旁肝细胞仅见胞核FOXP3表达,提示除淋巴细胞外,多种细胞尤其是肝癌细胞表达FOXP3,且肝癌细胞内FOXP3定位不同于癌旁细胞。1.3组织芯片分析发现,肝癌组织中的肝实质细胞,尤其是胞浆内FOXP3表达显著高于癌旁对照,且HBV阳性组肝癌细胞FOXP3表达显著高于HBV阴性组为研究肝癌细胞FOXP3表达与临床指标相关性,本研究选取180点肝癌组织/癌旁组织芯片,免疫组化检测FOXP3表达,结果显示FOXP3染色情况与石蜡标本相符。分别对肝癌及癌旁组织中肝实质细胞内胞浆胞核中的FOXP3染色强度和细胞数进行评分,Fisher’s exact检验与多项临床指标之间的相关性。结果显示肝癌组织总体FOXP3表达显著强于癌旁组织(97.67%vs85.37%,P<0.01),随肿瘤恶性程度增高FOXP3从胞核逐渐移向胞浆；进一步统计分析表明HBV阳性肝癌组织内高表达FOXP3的细胞比例显著高于HBV阴性组(92.6%vs50%,P=0.0025),提示HBV调控肝癌细胞中的FOXP3表达。1.4FOXP3在肿瘤细胞内的表达定位具有肿瘤特异性为研究FOXP3在不同来源肿瘤细胞中的表达模式,FOXP3抗体及荧光二抗染色乳腺癌细胞系MCF-7、前列腺细胞系PC3及肝癌细胞系HepG2, DAPI复染细胞核,激光共聚焦显微镜下观察发现：FOXP3表达主要定位于HepG2细胞的胞浆,核内几无表达；而在MCF-7和PC3细胞中,胞浆内虽然有中等强度FOXP3表达,但FOXP3主要强表达于细胞核。本实验再次证实FOXP3在肝癌细胞中主要定位于胞浆,与乳腺癌和前列腺癌不同,提示FOXP3在肿瘤组织中的表达定位存在肿瘤特异性。2HBV及其编码蛋白调控肝癌细胞中FOXP3表达2.1HBV及其编码蛋白过表达显著上调肝癌细胞系中FOXP3表达利用脂质体分别将HBV及其编码蛋白HBx/preS2/HBc表达载体转染HBV阴性的肝癌细胞系HepG2及Be17402。RT-PCR检测证明HBV及各基因片段均在肝癌细胞系中成功过表达；RT-PCR、western-blot检测FOXP3表达,结果显示HBV全长或片段过表达可显著上调肝癌细胞系中FOXP3mRNA和蛋白表达,其中HBx作用最强。2.2反义寡核苷酸(asons)封闭HBx/preS2/HBc表达抑制HepG2.2.15细胞中FOXP3表达脂质体转染针对HBx/preS2/HBc的反义寡核苷酸(asons)至整合有HBV DNA的肝癌细胞系HepG2.2.15细胞,RT-PCR结果显示各asons可以特异性抑制HBx、preS2及HBc表达；RT-PCR及western-blot检测FOXP3表达,结果显示反义封闭HBV各基因片段表达均可抑制HepG2.2.15细胞中FOXP3表达,其中针对HBx的ason作用最强。2.3CHB患者HBV-DNA(+)PBMC内FOXP3表达显著高于HBV-DNA (-) PBMC收集并分离60例CHB病人PBMC,提取病毒DNA, PCR检测HBV-DNA表达,据此将病例分为HBV-DNA阳性组和阴性组,比较两组间FOXP3表达差异。RT-PCR、实时荧光定量PCR及western-blot结果显示,PBMC HBV-DNA阳性组患者均为HBe-Ag阳性,且FOXP3表达水平明显高于HBV-DNA阴性组。本实验与体外细胞系实验结果相符,提示HBV可调控FOXP3表达。3HBV及其编码蛋白调控肝癌细胞FOXP3表达的转录激活机制3.1HBV各编码蛋白转录激活肝癌细胞FOXP3表达脂质体法分别将FOXP3系列截短启动子报告质粒转染入肝癌细胞系HepG2、 Be17402及HepG2.2.15,双荧光素酶报告基因检测分析发现：FOXP3启动子在不同肝癌细胞系中均有较高活性,其中,在整合有HBV基因的HepG2.2.15中的活性显著高于其他HBV阴性肝癌细胞系；肝癌细胞系中FOXP3核心启动子定位于转录起始点-465bp～176bp(pGL4.10--465/176).3.2HBV及其编码蛋白,尤其是HBx,在转录水平上调肝癌细胞FOXP3表达,调控作用呈剂量依赖性FOXP3核心启动子pGL4.10--465/176与HBV及编码蛋白表达载体共转染肝癌细胞系HepG2及Be17402,双荧光素酶报告基因检测结果显示：HBV及其编码蛋白,尤其是HBx/preS2过表达能显著上调启动子pGL4.10-465/176活性,且HBV及HBx/preS2对pGL-465/176的激活作用具有剂量依赖性；为进一步验证上述结果,将针对HBx/preS2/HBc的特异性asons与pGL4.10--465/176共转染HepG2.2.15,双荧光素酶报告基因检测,结果显示反义封闭HBV及其编码蛋白后pGL-465/176活性显著下调,其中针对HBx/preS2的asons抑制效果尤为显著,且呈现剂量依赖性。上述结果证明,HBV及其编码蛋白可以在转录水平上调肝癌细胞系中FOXP3表达。3.3HBx通过结合启动子-465～-445bp处的AP-1位点激活FOXP3启动子活性以pGL4.10-465/176为模板,设计引物,构建-465～-383bp之间20bp递减截短启动子报告载体；上述载体分别与HBx/preS2/HBc表达载体共转染肝癌细胞系HepG2及Be17402,双荧光素酶报告基因检测结果显示,缺失-465～-445bp间20bp后FOXP3启动子丧失对HBx反式激活作用的应答,提示HBx在FOXP3启动子上的调控位点定位于-465～-445bp间的20bp片段,软件分析发现该区域含有一个AP-1元件。设计引物,在-464bp位点上引入突变,构建转录元件AP-1突变的FOXP3启动子报告质粒。双荧光素酶报告基因检测结果显示,突变AP-1后,HBx的反式激活作用消失,提示HBx反式激活FOXP3依赖于其启动子上的AP-1结合位点：同时,针对HBx的反义寡核苷酸在HepG2.2.15细胞中得到了相似的结果。为进一步验证AP-1结合位点在HBx介导的FOXP3上调中的作用,脂质体转染pcDNA3-HBx-HA (pcDNA3空载体为对照组)入肝癌细胞48h后,提取细胞核蛋白,进行EMSA实验。结果显示,HBx可以与地高辛标记的20bp(-465～-445bp)寡核苷酸片段(probe*)结合,此种结合可被大量特异性未标记冷探针竞争性抑制,且HA抗体作用后结合带明显后滞,提示HBx可与FOXP3启动子上这一20bp区段特异性结合；使用含AP-1位点的商品化探针同样可以与核蛋白结合；而AP-1位点突变的商品化探针和突变目的探针上的AP-1位点后均不能与核蛋白结合。上述结果证实HBx可以与FOXP3启动子-465～-445bp上的AP-1位点结合。为验证AP-1在HBx介导的FOXP3激活中的作用,利用c-JUN的si-RNA抑制肝癌细胞HepG2中c-JUN表达,12h后转染HBx表达载体,RT-PCR、western-blot检测FOXP3表达,结果显示,在肝癌细胞系中封闭c-JUN表达显著削弱了HBx对FOXP3的上调作用。本实验提示,c-JUN/AP-1途径在HBx介导的FOXP3反式激活中发挥重要作用。3.4HBV及preS2/HBc反式激活FOXP3启动子关键位点的寻找HBV及preS2/HBc表达载体分别与FOXP3系列截短报告质粒共转染肝癌细胞系HepG2及Be17402,双荧光素酶报告基因检测发现,FOXP3启动子系列截短后仍可不同程度被HBV及preS2/HBc激活；同时,针对preS2/HBc的反义寡核苷酸在HepG2.2.15细胞中得到了相似的结果,提示preS2/HBc反式激活FOXP3启动子的关键位点与HBx不同,其具体机制有待于进一步研究。4肝癌细胞表达FOXP3生物学作用的体外研究4.1FOXP3促进肝癌细胞的增殖和集落形成FOXP3表达载体pCI-hFOXP3脂质体转染肝癌细胞系HepG2,生长曲线及集落形成实验结果显示：FOXP3过表达显著提高肝癌细胞体外增殖能力及集落形成能力。与此相符,特异性si-RNA封闭FOXP3高表达肝癌细胞系HepG2.2.15中FOXP3表达后,细胞体外增殖能力和集落形成能力明显减弱。上述结果显示FOXP3促进肝癌细胞体外恶性生长能力。HBx介导的细胞恶性增殖是HBV相关HCC的重要机制,为研究FOXP3在HBx介导的肝癌细胞恶性增殖中的作用,将HBx表达载体与si-FOXP3共转染HepG2细胞,CCK-8检测6天内细胞增殖能力,结果发现封闭FOXP3表达后明显抑制了HBx引起的细胞增殖,表明FOXP3参与了HBx介导的细胞恶性增殖。4.2FOXP3高表达促进肝癌细胞进入S期并上调细胞周期蛋白的表达流式细胞术检测细胞周期,结果显示,FOXP3转染组HepG2细胞S期比例显著高于空载体对照组；si-RNA封闭HepG2.2.15中FOXP3表达后,细胞S期比例下降,证明FOXP3高表达促进肝癌细胞进入S期,加快细胞增殖。为进一步研究FOXP3影响细胞周期的机制,RT-PCR、western-blot检测FOXP3过表达或siRNA抑制后细胞内细胞周期蛋白表达变化,结果显示FOXP3过表达上调肝癌细胞内cyclinE、cyclinA和CDK4的表达,并抑制P27的表达；相反,抑制FOXP3表达明显抑制HepG2.2.15细胞cyclinE、yclinA和CDK4的表达,并促进P27表达。上述结果提示FOXP3通过促进肝癌细胞进入S期而增强细胞增殖能力,该作用可能与FOXP3对细胞周期蛋白的调控有关。4.3FOXP3高表达促进肝癌细胞对CD4+T细胞增殖的抑制作用收集健康人外周血,分离PBMC,磁珠分离CD4+T细胞,并进行CFSE标记。FOXP3表达载体pCI-hFOXP3转染肝癌细胞系HepG2,24h后与磁珠分选、CFSE标记的CD4+T细胞共培养(以空载体转染肝癌细胞共培养组和T细胞单独培养组为对照),并加入CD3/CD28抗体刺激。3天后流式细胞术分析CD4+T细胞增殖。检测结果显示：空载体转染肝癌细胞可以抑制CD3/CD28抗体介导的CD4+T细胞增殖,而FOXP3过表达可以明显增强肝癌细胞对CD4+T细胞增殖的抑制作用。提示,FOXP3可能是肝癌细胞免疫逃逸的重要机制。第二部分HBV对TIM-3的表达调控T细胞免疫球蛋白粘蛋白样蛋白-3(T cell immunoglobulin—and mucin-domain-containing molecule3, TIM-3)是2002年Monney L等发现的、特异性表达在分化终末期Th1细胞上的新型免疫调节分子。TIM-3与其配体之一galectin-9相互作用可负向调控IFN-y的产生,并可影响T细胞耐受的形成。近期研究结果显示,细胞毒性T细胞(Tcl细胞)、树突状细胞、NK细胞及非淋巴来源细胞如黑色素瘤细胞上均表达TIM-3,且TIM-3参与多种疾病的发生发展过程。本室前期成功克隆并构建含有人TIM-3启动子的真核报告质粒,并且发现慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞和肝脏内单个核细胞上TIM-3表达明显升高,从而抑制NK细胞和CD8+T细胞的功能,提示TIM-3很可能在HBV相关疾病中发挥重要的作用。但肝癌细胞是否表达TIM-3, HBV是否通过调控TIM-3参与HCC发生发展,迄今尚未见报道。本课题利用临床研究、体外细胞实验初步研究TIM-3在HCC中的表达及调控,为进一深入阐明HBV相关HCC的发病机制提供新的实验依据。研究目的：1.研究TIM-3在HCC患者肝组织中的表达,明确HBV及其编码蛋白对TIM-3的调控作用；2.构建系列TIM-3启动子报告质粒,初步探讨HBV调控TIM-3启动子的作用。研究方法：1TIM-3在HCC中的表达及调控1.1免疫组化：收集50例HCC患者肝组织,石蜡包埋、切片。所有病人均为HBsAg(+)患者,术前未经抗病毒治疗,无HIV感染和过量饮酒史。根据Edmondson and Steiner进行肿瘤分级。免疫组化检测TIM-3表达情况。1.2细胞系过表达及封闭实验：HBV及其编码蛋白HBx/HBc/preS2表达载体(空载体为对照)脂质体转染HepG2及Bel7402细胞,48h后提取RNA及总蛋白,RT-PCR、 western-blot检测TIM-3表达；设计合成针对HBx/HBc/preS2的反义寡核苷酸(asons),脂质体转染入HepG2.2.15细胞(无关序列as-random转染组为对照),48h后RT-PCR、 western-blot检测TIM-3表达。2构建系列TIM-3启动子报告质粒,初步探讨HBV调控TIM-3启动子的作用2.1系列TIM-3启动子报告载体的构建：本室前期已成功将TIM-3转录起始点上游2083bp片段克隆入pGL3-Basic载体,以此载体为模板设计引物构建TIM-3启动子系列截短报告载体,分别在HepG2.2.15和B16细胞中利用双荧光素酶报告基因检测启动子活性,寻找核心启动子。2.2共转染实验及双荧光素酶报告基因实验：(参见第一部分)。研究结果1HCC患者癌组织多种细胞表达TIM-3,且TIM-3表达可以受HBV及其编码蛋白调控1.1HCC临床标本检测发现,TIM-3不仅表达于浸润淋巴细胞,且在肝癌细胞及其它细胞中表达免疫组化结果显示,TIM-3阳性染色可见于肝癌组织浸润淋巴细胞、库弗氏细胞(Kupffer’s cell)、肝细胞及小胆管上皮细胞。提示除淋巴细胞外,多种细胞尤其是肝癌细胞可表达TIM-3,且主要定位于胞浆。1.2CHB患者HBV-DNA阳性的PBMC内TIM-3表达显著高于HBV-DNA阴性PBMC收集并分离60例CHB患者外周血PBMC,根据病毒DNA的有无将病例分为HBV-DNA阳性PBMC组和阴性PBMC组(方法同第一部分),RT-PCR检测TIM-3mRNA表达,结果显示PBMC HBV-DNA阳性的CHB患者均为HBe-Ag阳性,且HBV-DNA阳性PBMC中TIM-3表达水平明显高于HBV-DNA阴性PBMC。1.3HBV及其编码片段上调肝癌细胞中TIM-3表达HBV及其编码蛋白表达载体脂质体转染(空载体为对照)肝癌细胞系HepG2及Be17402, RT-PCR结果显示,HBV及其编码蛋白转染组TIM-3表达均高于pcDNA3转染组；反之,针对HBV编码片段的反义寡核苷酸(asons)脂质体转染入HepG2.2.15细胞后(无关序列as-random转染组为对照),RT-PCR结果显示,asons转染组TIM-3表达明显低于as-random组。上述结果显示,HBV及其编码蛋白上调肝癌细胞TIM-3表达。2TIM-3系列截短启动子的构建及HBV对TIM-3的转录调控作用2.1TIM-3核心启动子活性定位于-231/242bp成功构建一系列TIM-3启动子pGL-2083/242、-1546/242、-1171/242、-639/242、-318/242、-253/242、-231/242、-88/242。启动子分析软件确定人、小鼠和大鼠启动子上的同源性区域和转录元件。双荧光素酶报告基因检测显示TIM-3启动子不仅在黑色素瘤细胞系B16细胞,而且在肝癌细胞HepG2.2.15中有较高活性,TIM-3核心启动子位于-231～242bp(pGL-231/242)。2.2HBV及其编码蛋白,尤其是preS2,可反式激活TIM-3启动子活性HBV及其编码蛋白与TIM-3核心启动子报告质粒pGL-231/242共转染肝癌细胞Be17402及黑色素瘤B16细胞,双荧光素酶报告基因检测结果显示HBV及其编码蛋白均可激活TIM-3启动子活性；同时,针对HBx/preS2/HBc的asons与pGL-231/242共转染HepG2.2.15细胞,结果显示,asons转染组启动子活性明显受到抑制。其中,preS2激活TIM-3启动子的作用尤为显著,并且呈剂量依赖性。本实验初步证实,HBV及其编码蛋白可以在转录水平上调细胞中TIM-3表达,其具体分子机制有待进一步研究。结论1.体外实验及HCC临床标本研究证实,肝癌细胞表达免疫相关分子FOXP3/TIM-3,并且HBV及其编码蛋白可调控肝癌细胞中FOXP3/TIM-3的表达。2.共转染、双荧光素酶报告分析及EMSA、si-RNA实验证实HBV及其编码蛋白可反式激活FOXP3启动子活性。HBx依赖于AP-1反式激活FOXP3启动子。3.FOXP3异常表达促进肝癌细胞体外增殖能力、增强对CD4+T细胞增殖的抑制作用,可能是HCC恶性增殖及免疫逃逸的重要机制。创新性和意义1.众多研究提示FOXP3/TIM-3可表达于肿瘤组织,但其在肝癌细胞中的表达及其生物学功能存在争议。本研究首次证实了免疫调节分子FOXP3/TIM-3在HCC中的表达。2.本研究深入探讨了HBV特别是其编码蛋白HBx转录激活FOXP3的分子机制及关键位点,发现HBx通过AP-1依赖性方式促进肝癌细胞表达FOXP3表达,丰富了HBV调控宿主关键基因表达机制的研究。3.研究发现FOXP3异常表达促进肝癌细胞体外生长及免疫逃逸,为阐明HBV相关HCC的发病机制提供了新的思路。4.研究初步证明HBV及其编码蛋白可以从转录水平调控TIM-3表达,但其机制及生物学意义有待进一步研究。