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猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)和猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是猪的两种重要传染病,目前在我国流行严重,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。能够区分野毒感染和接种疫苗动物(DIVA)的标记疫苗是目前控制和根除PR的有效策略之一。经典的基因缺失疫苗在防控PR中曾经起了重要作用,但近几年由于变异株的出现,导致免疫失败的现象时有发生。PED的再次流行增加了对相关疫苗的需求,目前多数使用的是弱毒活苗,存在一定的安全隐患。随着PRV活载体疫苗的研究应用,外源基因共同表达成为可能,多联疫苗得到了大家的广泛关注。S基因是PEDV的主要保护性抗原,是疫苗研究的首选靶蛋白。因此,本研究先通过同源重组构建针对PR变异株的rPRV-TX-gE-/TK-双基因缺失株,然后将PEDV的S1基因插入该双基因缺失株构建表达PEDV S1蛋白的重组病毒,为这两种猪病的防控提供疫苗候选株。1.猪伪狂犬病病毒gE/TK双基因缺失株的构建利用已构建的带有绿色荧光蛋白EGFP标记的pSKTKRL-GFP转移载体,通过蛋白酶K消化和苯酚抽提法提取了 rPRV-TX-gE-单基因缺失株的总DNA,运用磷酸钙沉淀法,将细胞总DNA和转移载体的量以10:1的比例共转染PK15细胞,待细胞出现80%病变时收获病毒,通过空斑纯化法筛选得到带有报告基因的重组病毒rPRV-TX-gE-/TK-/GFP。再运用Cre重组酶剔除报告基因,经空斑纯化获得剔除报告基因的双缺失株病毒。纯化病毒TK基因的序列测定显示TK基因缺失并保留一个loxP位点,证明双缺失株病毒构建成功,该病毒命名为rPRV-TX-gE-/TK-。2.猪伪狂犬病病毒rPRV-TX-gE-/TK-的生长特性及免疫效力研究对基因缺失株的生长曲线进行了测定,结果显示,单缺失病毒rPRV-TX-gE-在PK15细胞上的增殖速度与野生株相比较略高;双缺失株rPRV-TX-gE-/TK-在PK15细胞上的增殖速度与野毒株相比略低,差异不显著。在小鼠上进行LDs0的测定,结果显示,PRV-TX、rPRV-TX-gE-和 rPRV-TX-gE-/TK-对小鼠的 LDs0分别为 3.5×103、3.1×103 和>1×106TCID50。表明在gE基因缺失的基础上进一步缺失TK基因可使病毒的毒力显著降低。分别将双基因缺失株rPRV-TX-gE-/TK-和经典疫苗株Bartha-K61株以104 TCIDso剂量肌肉注射的方式免疫小鼠,分别于7 d、14 d和21 d采血分离血清,利用间接ELISA方法分别检测血清中针对变异毒株PRV-TX和经典毒株PRV-SZ的抗体,rPRV-TX-gE-/TK-免疫组在免疫后14 d和21 d均可检测到针对变异毒株PRV-TX与经典毒株PRV-SZ较高的特异性抗体;Bartha-K61免疫组在免疫后14 d和21 d可检测到针对经典毒株PRV-SZ较高的特异性抗体,而针对变异毒株PRV-TX的特异性抗体较低。免疫后21 d分别以104 TCIDs0剂量变异毒株PRV-TX和经典毒株PRV-SZ攻毒,结果表明,变异毒株PRV-TX攻毒后7 d,rPRV-TX-gE-/TK-和 Bartha K61组的保护率分别为100%和0;经典毒株PRV-SZ攻毒后7 d,rPRV-TX-gE-/TK-和Bartha K61组的保护率分别为20%和70%。变异毒株PRV-TX攻毒后14d,rPRV-TX-gE-/TK-的保护率降为30%,结果表明,rPRV-TX-gE-/TK-双缺失株针对变异毒株的致死性攻击7 d内能够提供完全保护;对经典毒株的攻毒也能起到一定的保护作用。而Bartha-K61株只对经典毒株有较好的保护作用,对目前流行的变异毒株没有保护作用。3.表达PEDV S1基因重组伪狂犬病病毒的构建根据GenBank发表的PEDV基因序列设计引物,扩增PEDV的纤突蛋白S1基因,长度为2376 bp,将其克隆至含有PRV的TK基因上、下游同源臂的转移载体pSKTKRL-GFP中,构建重组PRV转移质粒pSKTKRL-PEDV-S1。采用磷酸钙转染法共转染将重组质粒pSKTKRL-PEDV-S1与带有荧光标记的双缺失株病毒rPRV-TX-gE-/TK--GFP基因组DNA共转染PK15细胞,通过反向筛选EGFP阴性蚀斑,纯化得到表达PEDV S蛋白的重组伪狂犬病毒rPRV-TX-gE-/TK--S 1,经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)试验和Western-blot鉴定,S1基因已成功插入重组病毒rPRV-TX-gE-/TK--S1的基因组中并得以表达。在小鼠上进行 LD50 的测定,结果显示,Bartha-K61 株的 LD50 为 3.5× 104TCID50,而 rPRV-TX-gE-/TK-和 rPRV-TX-gE-/TK--S1 的 LD50均为>1×106,表明表达 PEDV S1 蛋白的 rPRV-gE-/TK--S1与rPRV-TX-gE-/TK-双基因缺失株的LD50相同。