目的:　　观察缺血缺氧微环境对肝卵圆细胞(hepatic oval cell，HOC)自噬的诱导，观察自噬对HOC在缺血缺氧微环境中增殖和分化能力的影响，通过对自噬抑制前后体外培养的肝卵圆细胞增殖和分化能力情况观察，发现自噬对肝卵圆细胞功能维持的重要性以及自噬诱发肝肿瘤的可能机制。　　方法:　　1.缺血缺氧模型的建立和分组。　　将肝卵圆细胞接种于培养皿，当细胞密度达80％～90％时，弃旧培养基，加入无血清1640培养基，放入密封培养罐后迅速放入AnaeroPack（安宁包）产气袋一袋和氧气指示剂一枚，密封，45min后开始计时。分别缺血缺氧0，2，4，8和24h，每个时间点设置单纯缺血缺氧缺氧组(ischemia-hypoxia组)，缺氧前用20umol/L氯喹(CQ)预处理肝卵圆细胞1h作为缺血缺氧+氯喹(ischemia-hypoxia+CQ组)，同时设立正常对照(control组)即缺血缺氧0h组，和单纯加入20umol/L氯喹的对照组。　　2.肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中的增殖和分化能力变化观察。在缺血缺氧微环境中培养HOC0、2、4、6、8、10和24 h后应用CCK-8试剂盒检测比较肝卵圆细胞的增殖能力变化，并观察肝卵圆细胞形态变化。　　3.肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境条件下自噬水平变化检测。将分离纯化培养的大鼠肝卵圆细胞培养至对数生长期，通过无血清培养基和1％氧气条件下培养0、2、4、8和24h，不同时间点分别收集细胞，通过免疫荧光细胞化学染色法观察细胞自噬情况，运用Western Blot法检测LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白水平;应用丹（磺）酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色荧光定位法，观察绿色点状荧光的数量和分布，观察缺血和缺氧培养后不同时间点自噬水平的变化。　　4.抑制自噬对肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中增殖分化潜能的影响观察。运用经典自噬抑制剂氯喹抑制细胞自噬后运用CCK-8试剂盒检测比较肝卵圆细胞的增殖能力变化，并观察肝卵圆细胞形态变化，并与自噬未抑制前比较。　　5.抑制自噬后肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境条件下自噬水平变化检测。运用自噬抑制剂氯喹抑制细胞自噬，通过免疫荧光细胞化学染色法观察细胞自噬情况，运用Western Blot法检测LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白水平;应用丹（磺）酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色荧光定位法，观察点状荧光颗粒的数量和分布，观察自噬被抑制后细胞在缺血和缺氧培养后不同时间点自噬水平的变化，并与自噬未抑制前比较。　　6.运用Hoechst33258染色观察抑制自噬前后细胞凋亡情况。　　7.统计学处理:用统计软件SPSS19.0统计分析，计量资料用均数±标准差(M±SD)，两样本比较采用成组t检验，组间差异比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。　　结果:　　1.肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境条件下培养0、2、4、8和24 h后，从2h开始随着缺血缺氧时间的延长，肝卵圆细胞的存活率明显下降，细胞形态变化也越来越明显。　　2.肝卵圆细胞经处理后，与对照组相比，随着缺血缺氧的时间的延长，细胞免疫荧光观察到肝卵圆细胞胞浆LC3表达量显著上升，Western Blot法检测到缺血缺氧作用细胞后LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值和LC3-Ⅱ的表达都显著增加。　　3.丹（磺）酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色荧光检测，激光共聚焦显微镜观察显示，缺血缺氧诱导大量荧光颗粒分布于肝卵圆细胞胞浆及核周，显著高于正常对照细胞，以及自噬抑制前明显高于抑制后。　　4.加入氯喹后，细胞在缺血缺氧微环境条件下的存活率较加入前明显下降。　　5.Hoechst33258染色观察显示:随着缺血缺氧时间延长凋亡细胞增加。缺血缺氧处理相同时间比较，抑制自噬后比抑制前凋亡细胞明显增多，凋亡特征更明显。　　结论:　　1.CCK-8结果显示肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中存活率下降，说明缺血缺氧可以抑制细胞增殖。　　2.细胞免疫荧光观察到肝卵圆经缺血缺氧处理后细胞胞浆LC3表达量显著上升，Western Blot法检测到缺血缺氧作用细胞后LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值和LC3-Ⅱ的表达都显著增加，说明缺血缺氧微环境可以诱导肝卵圆细胞发生自噬。　　3.MDC染色荧光检测结果也支持缺血缺氧微环境可以诱导肝卵圆细胞发生自噬。　　4.抑制自噬后，细胞在缺血缺氧微环境条件下的存活率较抑制前明显下降，及Hoechst33258染色观察结果说明自噬有利于肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中稳定细胞内环境，维持细胞的存活。　　5.由此可以推断:缺血缺氧可以抑制肝卵圆细胞增殖，并且可诱导肝卵圆细胞自噬;自噬有利于肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中稳定细胞内环境，维持细胞的存活，自噬对肝卵圆细胞适应恶劣环境具有重要作用，为肝卵圆细胞临床运用奠定基础。