【摘 要】
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由2型严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-Co V-2)引起的一系列被称为新型冠状病毒肺炎2019(COVID-19)的呼吸道感染的爆发对世界健康和经济产生重大影响。该病毒可以通过飞沫、接触和污染物在人与人之间迅速传播,所以快速准确检测出病毒基因组或病毒抗原,防止该病毒大规模传播就显得尤为重要。目前针对COVID-19的检测方法分为三类:病理学检测、核酸检测和血清学。病理学检测主要依赖临床表
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由2型严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-Co V-2)引起的一系列被称为新型冠状病毒肺炎2019(COVID-19)的呼吸道感染的爆发对世界健康和经济产生重大影响。该病毒可以通过飞沫、接触和污染物在人与人之间迅速传播,所以快速准确检测出病毒基因组或病毒抗原,防止该病毒大规模传播就显得尤为重要。目前针对COVID-19的检测方法分为三类:病理学检测、核酸检测和血清学。病理学检测主要依赖临床表现,潜伏期一般较长,患者血清转化通常在初始症状发作后5-10天发生,而利用核酸诊断方法-基于实时RT-PCR方法检测新冠病毒,耗时较长因此不能满足当前测试大量疑似患者、无症状患者和密切接触者检测的需求。迫切需要一种快速、简单、灵敏、特异、经济且适用于在基层大规模检测SARS-Co V-2的核酸检测方法。逆转录环介导等温扩增技术(Reverse Tr anscription Loop-Mediated Isothermal Amplification)是一种新型核酸扩增技术,RT-LAMP反应能高效快速准确方便的鉴定病原微生物,因其简便、快捷、特异性强、灵敏度高等特点已经成功应用于对部分病原体、病毒、真菌的检测。本研究针对SARS-Co V-2基因中的保守序列,设计引物,建立RT-LAMP检测方法,为早期鉴定SARS-Co V-2感染提供了一种有效的技术手段,主要研究成果如下:(1)对反应温度、镁离子浓度、BST酶用量、内外引物浓度比、SYBR GreenⅠ荧光染料浓度等条件进行了优化,并且为了克服LAMP方法假阳性缺点,建立d UTP/UDG防污染系统,并通过筛选一系列PCR增强剂,得出通过向反应体系中添加DMSO、BSA可进一步提高反应速率及稳定性,最终确定优化后的R T-LAMP反应体系。(2)用建立的RT-LAMP方法对三种冠状病毒和靶序列进行检测,结果显示对靶序列的检测结果为阳性,其他冠状病毒检测结果均为阴性,说明该方法特异性好。(3)用建立的RT-LAMP方法对设计的模板核酸进行灵敏度检测,最低检测限为:9.2×10~1copies/μL。本研究成功建立了RT-LAMP快速检测SARS-Co V-2的新方法,该方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强、简便快捷等优点,为基层现场检测SARS-Co V-2提供了技术支持,具有很好的发展前景。
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