【摘 要】
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研究背景膀胱输尿管反流（Vesicoureteral Reflux,VUR）是神经源性膀胱（Neurogenic Bladder,NGB）患者疾病进展中不可避免的病理生理过程。持续性的VUR可能引起肾积水、肾衰竭甚至死亡,严重影响着患者的生活质量。目前,临床上对诊断和预警VUR的发生相关的无创性生物学指标尚未明确。研究目的1.旨在识别VUR和Non-VUR组尿液外泌体的不同蛋白谱,并探索是否存在潜
【基金项目】
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深圳市科技创新委员会基础研究面上项目（JCYJ20190814113003711）,（JCYJ20210324142406016）；
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研究背景膀胱输尿管反流（Vesicoureteral Reflux,VUR）是神经源性膀胱（Neurogenic Bladder,NGB）患者疾病进展中不可避免的病理生理过程。持续性的VUR可能引起肾积水、肾衰竭甚至死亡,严重影响着患者的生活质量。目前,临床上对诊断和预警VUR的发生相关的无创性生物学指标尚未明确。研究目的1.旨在识别VUR和Non-VUR组尿液外泌体的不同蛋白谱,并探索是否存在潜在生物标志物能够诊断VUR和预警尿路功能恶化。2.初步探究所鉴定出的候选标志物分子与下尿路损伤进展的关系及影响机制。研究方法1.收集符合入选标准的VUR及Non-VUR组的尿液标本。采用超高速离心法分离提取尿液外泌体样本。通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析以及蛋白质免疫印迹（Western Blotting,WB）测量外泌体表征蛋白（Alix及CD63）对外泌体进行鉴定。2.通过串联质谱标签技术（Tandem Mass Tags,TMT）鉴定VUR组和Non-VUR组尿液外泌体的差异性蛋白。利用生物信息学分析方法筛选与VUR疾病相关的蛋白分子。3.采用平行反应监测（Parallel Reaction Monitoring,PRM）、WB和酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）对候选标志物进行筛选和验证,并计算ROC曲线（Receiver Operating Characteristic Curve,ROC）,从而确定具有诊断及预警功能的蛋白分子。4.收集膀胱纤维化手术标本及非纤维化手术标本各5例。通过WB及免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）技术对TGF-β1/Smad2/3通路激活状态以及候选标志物表达进行对比分析。研究结果1.临床资料显示:VUR组比Non-VUR组膀胱顺应性下降、膀胱内压升高及膀胱残余尿量增加。外泌体鉴定结果表明:VUR组外泌体的平均直径比Non-VUR组更大,且表达更多的外泌体标记蛋白分子。2.TMT蛋白质质谱分析发现:VUR组与Non-VUR组间尿液外泌体蛋白质组具有显著性差异,以差异表达量变化1.5倍作为筛选阈值,共鉴定出99个表达上调蛋白,134个表达下调蛋白。经过对差异蛋白的生物信息学分析后,共筛选出18个候选蛋白。3.生物信息学分析表明:18个候选蛋白中大多数与细胞外囊泡/外泌体的生物学机制相关。功能富集分析显示:18个候选蛋白与纤维化机制、TGF-β1信号通路、再生功能等高度相关,尤其是VTN、MBP、COL1A1和ITIH4这4个蛋白。4.PRM及WB结果显示:仅有玻连蛋白（Vitronectin,VTN）和COL1A1存在显著性差异。而ELISA结果显示:仅有VTN在VUR组及Non-VUR组之间存在显著性差异。ROC结果显示:VTN的ROC曲线下面积（Area Under Curve,AUC）为0.795（95%CI,0.667-0.923）,诊断敏感度为80%,特异性为82.9%。5.膀胱组织的WB及IHC结果显示:在膀胱组织发生纤维化过程中,存在着TGF-β1/Smad2/3信号通路的高度激活及VTN与COL1A1的蛋白表达增加。结论尿液外泌体中的VTN可作为诊断VUR出现及预警下尿路功能恶化的无创性生物学标志物。VTN介导的TGF-β1/Smad2/3信号通路激活可能是膀胱组织发生重塑及纤维化的机制之一。
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