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亲环素A (CypA)是一种具有极高保守性的伴侣蛋白,分子质量为20KD,是亲环素家族(Cyclophilins, Cyps)的重要一员。CypA最早在牛胸腺中发现,具有参与蛋白折叠、炎症应答以及介导细胞信号传导等功能。随着对CypA研究的不断深入,发现越来越多的疾病与CypA的表达有关,近年来关于CypA对病毒复制的相关作用的研究也越来越多。本实验重点研究猪亲环素A在猪乙型脑炎病毒(JEV)复制过程中的作用,就猪CypA对JEV复制的影响进行以下研究。1.猪CypA的真核表达载体的构建及猪流行性乙型脑炎病毒实时荧光定量检测方法的建立根据GenBank上猪CypA的基因序列,设计一对猪CypA基因的特异性扩增引物,上、下游引物分别添加KpnI、Xhol限制性酶切位点。从实验室保存的pET30-CypA重组载体上克隆猪CypA基因并连接至pMD19-T Simple vector,然后以KpnI、XhoI双酶切消化pMD19-T-CypA载体,回收CypA基因目的片段,连接至KpnI、XhoI双酶切消化的pcDNA3.1 (+)载体,构建pcDNA3.1-CypA并测序。结果显示,猪CypA基因插入方向与位点完全正确。根据GenBank上猪JEV E的基因序列,设计一对猪JEV E基因的特异性扩增引物进行JEV E基因的扩增,并将扩增所得产物连接至PMD19-T载体,作为标准品构建JEV荧光定量标准曲线,并做特异性、灵敏性和重复性试验。结果表明其特异性、灵敏性和重复性均较好,JEV阳性样品扩增得到“S”型曲线,可检测最低模版浓度为6copies/μL。2.重组pcDNA3.1-CypA对JEV复制的影响参照去内毒素质粒提取试剂盒方法,提取真核表达质粒pcDNA3.1-CypA和空载体pcDNA3.1 (+)后,用脂质体转染法转染BHK-21细胞,同时设不转染空白对照组。利用Westen blotting鉴定真核表达载体在细胞内的表达。以JEV-SC-1株病毒分别感染pcDNA3.1-CypA、pcDNA3.1(+)转染细胞与空白对照细胞,感染后收集不同时间点的感染细胞和上清。用JEV实时荧光定量检测方法检测样品中JEV含量,并根据所测结果绘制JEV生长曲线。结果显示pcDNA3.1-CypA、pcDNA3.1(+)转染组,细胞内JEV生长规律与对照组相似,三组细胞内病毒一步生长曲线变化无明显差异。而细胞外JEV一步生长曲线存在较大差异,pcDNA3.1-CypA组,与对照组细胞相比JEV感染后0-20h,细胞外JEV含量无明显差异,感染后20-72h,pcDNA3.1-CypA组JEV含量显著高于对照组细胞。pcDNA3.1组感染后,与对照组无明显差异。3. CypA蛋白对猪乙型脑炎病毒复制的影响JEV-SC-1株感染BHK-21细胞后,添加含不同浓度CypA蛋白的1640培养液培养进行培养,并收集不同时间点的上清和感染细胞,以JEV荧光定量检测法分析不同样品中病毒RNA含量并绘制生长曲线。结果显示添加不同浓度猪CypA蛋白组细胞内JEV含量与对照组无明显差异。添加不同浓度猪CypA蛋白组细胞外JEV含量存在较大差异。添加不同浓度猪CypA蛋白处理的三个组,JEV一步生长曲线规律与对照组相似,但添加猪CypA蛋白后,0-12h各组间差异不明显,12-72h添加CypA蛋白的三个组病毒RNA含量均高于对照组,在对数生长期,添加猪CypA蛋白以后JEV增殖速度比对照组快,0.3mg/mL与0.5mg/mL两个处理组在感染16h后,病毒RNA含量均高于对照组,0.1mg/mL处理组在感染后60-84h病毒RNA含量与对照组无明显差异。感染后20-60h,除36h外其他时间点抽样检0.5mg/mL组病毒RNA含量均高于0.3mg/mL与0.1mg/mL组。