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A型塞内卡病毒(Seneca VriusA,SVA)属于小RNA病毒科塞内卡病毒属,对猪具有传染性和致病性。症状类似于口蹄疫、猪传染性水疱病和猪水泡性口炎,成年猪感染初期出现嗜睡、厌食和发热,随后鼻镜部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位出现大小不一的水疱,严重者造成溃烂和跛行。7日龄以内的仔猪死亡率高达70%,偶尔伴有腹泻症状。2014-2015年SVA给巴西养猪业造成严重经济损失,同年SVA首次出现在我国广东地区,属于新型外来病。常用检测方法有病毒的分离鉴定、常规RT-PCR、荧光定量RT-PCR、病毒中和试验、利用表达SVA蛋白构建ELISA等。SVA只有一个阅读框,VP1、VP2和VP3构成该病毒的衣壳蛋白。研究表明,以VP2蛋白作为包被抗原的ELISA检测方法其特异性和灵敏度优于包被抗原为VP1蛋白或VP3蛋白。本试验利用构建的SVA-VP2蛋白作为抗原,建立SVA血清抗体间接ELISA和均相光激化学发光免疫技术(AlphaLISA)检测方法,为SVA-VP2蛋白的免疫原性的研究及SVA血清学检测试剂盒和基因工程疫苗研究奠定基础。本试验根据SVA分离株GD01/2017中的VP2基因,利用pet-30a载体特性和蛋白特点进行引物设计与合成。用RT-PCR成功扩增出大小为870 bp的VP2基因片段,经过克隆转化得到阳性质粒并名为pet30a-VP2重组质粒。随后将重组质粒转入Rosetta(DE3)大肠杆菌中,经过优化诱导温度和时间,在18℃ 12 h成功表达出大小为47KDa的VP2蛋白,同时蛋白质属于部分可溶性蛋白,利用Ni柱亲和层析法进行非变性蛋白纯化,得到高纯度VP2蛋白质,应用Western-blot方法检测VP2蛋白具有免疫反应原性。以纯化后VP2蛋白作为包被抗原,构建间接ELISA方法。用方阵滴定法确定VP2蛋白包被量为2 μg/ml,标准阳性血清最适稀释倍数为1:20。反应条件优化结果,最佳封闭液为2%BSA封闭液,酶标IgG最适稀释度为1:5 000,TMB底物显色液室温避光显色反应10 min。该方法检测灵敏度为1:160;特异性试验结果显示,同猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胸膜肺炎(APP)的阳性血清均无交叉反应;批间、批内重复性试验结果,变异系数均小于10%;对200份临床血清样本检测结果显示,该方法同中和试验(VNT)的符合率为95.5%。将纯化的VP2蛋白经过生物素标记,并建立AlphaLISA方法。对反应条件优化结果显示,总反应体系为25μL,总反应时间为2h。该方法检测灵敏度为1:320;特异性试验结果显示,同FMDV、PRRSV、CSFV、PRV、APP和PEDV 阳性血清均无交叉反应;重复性试验结果,变异系数均小于10%。本试验成功表达出可溶性VP2蛋白,初步建立检测SVAVP2抗体的间接ELISA和AlphaLISA血清学方法,均有较好的特异性、灵敏性和稳定性。