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牛樟芝是一种生长于台湾的珍稀药用真菌,包含多糖、黄酮、三萜等多种活性成分,具有抗肿瘤、抗炎症、增强免疫、保肝和护肝等多种功效。其中,三萜类化合物含量丰富,赋予牛樟芝子实体以苦味,是最重要的药用资源研发对象之一。目前,对牛樟芝三萜的研究主要集中在培养基优化、生产工艺优化和子实体成分研究等方面。对于三萜类单一化合物的分离纯化及构效关系的研究则较少,限制了该资源的应用。针对这一问题,本课题在前期固态发酵优化的基础上,对牛樟芝菌丝体三萜类化合物进行分离纯化,并对其体外抗肿瘤活性与作用机制进行研究。主要的研究结果如下:1.在80℃条件下,以80%乙醇溶液对固态发酵菌丝体进行提取,固液体积比为1:60。再经石油醚萃取,除去脂类物质,获得的提取物即是牛樟芝粗三萜(Antrodia cinnamomea triterpenoids,ACTs)。以香草醛-冰醋酸法进行检测,计算得三萜含量为15.90±0.90 mg/g。2.采用硅胶柱层析对ACTs进行分离。经优化,确定洗脱剂为异丙醇/石油醚混合液(体积比1:4)和蒸馏水,最优径高比为1:8。洗脱过程中,先以两倍柱体积的异丙醇/石油醚混合液进行洗脱,再以两倍柱体积的蒸馏水进行洗脱,以每8min一管的速度进行收集。通过香草醛-冰醋酸法检测,收集到两个组分。其中以异丙醇/石油醚为洗脱剂收集的组分命名为ACTs-a;以蒸馏水为洗脱剂收集的部分命名为ACTs-b。3.利用高效液相色谱HPLC对ACTs、ACTs-a和ACTs-b进行纯化。结果表明ACTs的图谱中出峰数量最多,ACTs-a其次,ACTs-b的出峰最少。说明经硅胶柱层析分离后,所获得的不同组分含有的物质不同。ACTs-a的HPLC图谱中分别在12min、14 min和15.5 min显示出三个明显的峰,但12 min和15.5 min出峰的物质不稳定,随着样品放置的时间变化,含量也会随之变化。因此,本研究主要收集ACTs-a中14 min出峰的物质,并经HPLC反复纯化,得到三萜组分ACTs-c。4.利用LC-MS检测ACTs-c组分,再通过数据库比对,分析ACTs-c组分中含有的成分。结果显示,ACTs-c以Limonin衍生物为主,同时含有微量黄酮类、脂类和糖类等杂质。5.利用体外抗肿瘤试验,对上述ACTs、ACTs-a、ACTs-b和ACTs-c四种三萜组分的活性进行比较。结果发现,ACTs、ACTs-a和ACTs-c均能显著抑制He La细胞增殖,最大抑制率分别为84.37%、93.51%、97.00%;半数抑制浓度IC50分别为492.29μg/m L、18.94μg/m L、36.91μg/m L。6.在上述基础上,进一步开展了抗肿瘤作用机理的研究。运用Annexin V-FITC/PI双染法处理He La细胞,采用流式细胞术来检测细胞周期阻滞的情况。结果表明,在ACTs的作用下,He La细胞的DNA复制过程阻滞在G2/M期,停留在S期的细胞比例下降;在ACTs-c的作用下,He La细胞的DNA复制过程阻滞在S期,停留在G1期的细胞比例下降。利用Western Blot技术,检测细胞内相关蛋白的表达水平,结果显示:在ACTs的作用下,细胞周期蛋白Cyclin B1表达量显著下调,CDK1蛋白表达维持不变。这说明G0/G1期阻滞伴随着Cyclin B1/CDK1复合物的下调。与对照相比,经过ACTs-c处理后的He La细胞中Bcl-2蛋白的表达下调,Bax和P53蛋白表达上调,且呈浓度依赖效应。说明,ACTs-C是通过P53信号通路介导的线粒细胞体凋亡,实现对He La细胞增殖的抑制。综上所述,本研究由牛樟芝菌丝体中分离的粗三萜ACTs中,纯化得到了抗肿瘤活性显著的组分ACTs-c(以Limonin衍生物为主要成分,参杂微量黄酮类、脂类和糖类等物质),通过引发肿瘤细胞的周期阻滞,进而诱导细胞发生凋亡。显示该组分具有开发成为抗肿瘤药物或者保健食品的潜力,后续将进一步完成结构解析和体内功能验证,为其开发应用奠定基础。