山东省水貂肠炎细小病毒(MEV)毒株的分离鉴定及β干扰素对其复制抑制效果分析

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我国是水貂养殖大国,其中山东省水貂养殖占全国的60%以上。水貂养殖已成为山东省的一大特色产业,也带动了农民致富和山东省地方经济发展。水貂肠炎细小病毒病(ME)是危害水貂养殖业的三大传染病之一,主要引起感染水貂严重腹泻、脱水、甚至死亡,每年给水貂养殖业带来严重损失。干扰素(Interferon,IFN)是机体内一种重要的先天性免疫防御因子,在正常情况下,干扰素基因处于被抑制状态,一旦接受到病毒刺激,便会诱导多种抗病毒因子的表达,起到抗病毒的作用。IFN-β属于I型干扰素,作为免疫过程中重要的中间诱导分子和效应分子,其抗病毒作用受到广泛关注。本研究主要调查检测山东省水貂肠炎细小病毒感染情况,分离鉴定毒株,分析水貂IFN-β对毒株的抑制效果,为临床防控水貂肠炎细小病毒病提供科学依据。首先,从山东省内五个地区收集水貂病料,利用PCR方法检测水貂MEV感染情况,通过CRFK细胞培养分离出MEV毒株,并通过生物学软件分析了该分离株的与其他MEV毒株的基因同源性以及生物进化关系。其次根据Gen Bank上已经发表的水貂β干扰素基因序列设计引物,扩增了水貂β干扰素基因;利用大肠杆菌原核表达技术制备水貂β干扰素表达产物;经纯化、复性、浓缩后利用VSV/CRFK系统结合细胞病变检测抗病毒活性。第三,利用CRFK细胞增殖MEV,添加不同浓度β干扰素表达产物,检测细胞病变和病毒含量等变化,分析该蛋白对MEV的抗病毒活性。结果显示,山东省五个地区市的水貂样品均检测出MEV的感染,样品检测阳性率为45%(45/100)。从阳性样品中分离出一株新MEV毒株,命名为MEV-SD-Z-2020,该毒株可在CRFK细胞上出现明显细胞病变,TCID50为10-3.75/0.1m L;PCR扩增毒株VP2基因全长序列大小为1755 bp;生物信息学分析显示该分离株与国内外毒株的同源性在96.4%~98.1%之间,与国内已报道的黑龙江(HLJ)毒株的亲缘关系最近。设计引物从水貂肝脏样品中扩增出β干扰素498 bp左右的基因片段,成功构建含β干扰素基因的重组表达载体,经IPTG诱导获得37 KDa大小的重组水貂β干扰素蛋白产物,纯化复性后其浓度为0.8 mg/m L。复性后的水貂IFN-β表达产物蛋白对VSV具有明显抗病毒活性,浓度2μg/m L时对病毒的抑制效果最高,抑制效率达94%左右;对MEV复制的抑制率在72%左右,抑制作用可持续48 h,最高抑制效率可达83%。以上结果得出,山东省水貂养殖地区MEV感染较为普遍,分离的毒株与近些年来报道的毒株同源性在95%以上,利用研制的水貂β干扰素蛋白产物能够显著抑制该毒株的复制,这为山东乃至全国水貂肠炎细小病毒病的临床防治提供科学依据。
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