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几丁质酶基因与β-1,3-葡聚糖酶基因是植物中两类主要的防卫基因。其编码产物几丁质酶与β-1,3-葡聚糖酶都是水解酶,可分别水解真菌细胞壁的主要成份几丁质和葡聚糖,从而抑制真菌的生长与增殖。几丁质酶与β-1,3-葡聚糖酶可协同作用,即当植物在受到病原菌侵入时,β-1,3-葡聚糖酶先于几丁质酶合成,它融解真菌细胞壁释放的寡聚糖可成为诱导几丁质酶的活性激发子,诱发几丁质酶产生而降解真菌的几丁质,从而增强植株抗真菌的活性。
本研究从华农野生蕉、海南野生蕉和指天蕉等12种香蕉类作物中克隆了β-1,3-葡聚糖酶基因的部分片段,通过序列比较分析发现,来源于海南野生蕉、华农大甜蕉、华农野生蕉、巴西蕉、云南滑蕉、东莞大蕉和抗枯一号的葡聚糖酶基因片段与NCBI上己发表的香蕉类β-1,3-葡聚糖酶基因同源性比较接近,核苷酸比较相似性均在97%以上,而广州粉蕉、红蕉、孟加拉粉大蕉、皇帝蕉和指天蕉之间的葡聚糖酶基因片段的相似性较接近,但均与NCBI上已发表的香蕉类β-1,3-葡聚糖酶基因序列相似性较低,均在70%左右,初步推断有可能是β-1,3-葡聚糖酶基因的一个尚未报道的新的葡聚糖酶基因。本研究采用eDNA末端快速扩增技术(RACE法),在指天蕉样品叶片中得到了一个大小为1114 bp的β-1,3-葡聚糖酶基因全长,并对其全长进行了序列分析。发现其在N端有一个信号肽序列,具有强烈的跨膜信号,疏水性显著,序列本身包含一个310个氨基酸的保守区域。这为β-1,3-葡聚糖酶基因构建到植物表达载体提供了种质资源。
本研究同时从心叶烟中分离得到了一种切除信号肽序列的I型几丁质酶基因(pch),该基因序列全长973 bp,具有几丁质酶基因的保守结构域,由于切除了信号肽,因此它可以分泌到胞外,对分布在细胞问隙的病原真菌起作用,可以大大增强抗真菌作用。
为了进一步研究pch基因的功能,本研究将去除了信号肽的pch基因序列克隆到原核表达载体pET28b(+)上,构建成带有组氨酸标签的原核表达载体pET28b(+)-pch,并转化到高效表达菌株E.coli BL21 (DE3)和E.coli Rossetta(DE3)中,经过IPTG和自动诱导培养后,通过SDS-PAGE分析表明含有pET28b(+)-pch的大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)和Rossetta(DE3)在IPTG诱导下,没有表达,但在自动诱导培养下,获得了低水平的表达。