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目的:通过对幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)相关胃病患者不同病种、中医证候的病理组织学、炎症相关细胞因子IL-1β-511、TNF-α-308基因多态性检测以及Hp相关胃病患者胃黏膜转录组的定性分析,以健康受试者为对照,从中医证候着手,探讨Hp相关胃病的发病机理及演变过程,研究结果对疾病的发生和发展具有一定的预测性,以进一步完善对Hp相关胃病由良性至恶性变化发展机制的现代研究。方法:一、病例来源:本论文纳入的慢性胃炎及消化性溃疡病例均由课题组成员在2012年9月至2014年10月于广州中医药大学第一附属医院内窥镜室收集且符合纳入标准的患者。其中慢性胃炎患者186例(包括慢性浅表性胃炎73例,慢性浅表性胃炎伴糜烂87例,慢性萎缩性胃炎20例,慢性萎缩性胃炎伴糜烂6例),消化性溃疡患者61例(包括十二指肠球部溃疡及胃溃疡)。胃癌病例来源于(2014年5月至2014年10月)广州中医药大学第一附属医院胃肠外科手术切除标本,共24例。所有纳入病例根据其中医证素辨证要点及证候诊断标准,诊断为脾胃湿热证组88例(其中Hp阳性75例;Hp阴性13例)、脾气虚证组78例(Hp阳性59例;Hp阴性19例)、肝胃不和证组81例(Hp阳性59例;Hp阴性22例)和瘀血内阻证组24例(Hp阳性20例;Hp阴性4例);同时招募健康受试者20例为正常对照组,均签署知情文件。二、胃黏膜标本采集:符合纳入标准受试者均行电子胃镜检查,分别于胃窦距幽门口 2-3cm处大、小弯及前后壁各钳取1块组织,共4块,其中1块即刻行快速尿素酶检测Hp,1块放入4%多聚甲醛液中固定,备病理和组织Hp感染检测,另2块投入装有DNA/RNAlater的冻存管后立即放入液氮中并运输至-60℃低温冰箱保存,备一代直接测序和二代Hiseq测序检测;胃癌标本则对手术切除的癌肿组织、癌旁2-3cm组织各剪取3块组织,癌肿远端组织剪取4块组织,共10块。其中癌肿远端任一块组织采用快速尿素酶试验检测Hp的感染情况;其余处理同前。三、Hp检测、胃黏膜组织学评估:采用快速尿素酶和美兰染色两种方法,确定Hp感染及评估Hp感染程度;采用HE染色法,光学显微镜下观察各胃黏膜组织样本炎症程度、活动性、肠化生、萎缩、异型增生以及癌变的情况。四、基因多态性检测:提取胃黏膜组织DNA,进行PCR扩增并质量鉴定后,采用一代直接测序法对其产物进行IL-1β-511、TNF-α-308基因多态性检测。五、转录组学定性分析:提取胃黏膜组织RNA,逆转录成cDNA后,进行PCR扩增并质量鉴定,采用二代HiSeq测序法对Hp相关胃病患者证候及相关体质、病种进行转录组定性差异的分析。结果:一、一般资料:本研究病例之脾胃湿热证、脾气虚证、肝胃不和证及瘀血内阻证各组的平均发病年龄均大于正常对照组;瘀血内阻证、肝胃不和证与脾胃湿热证男性发病率均高于脾气虚证(P<0.05),其余证候在年龄、病程、性别以及病种性别分布方面无显著性差异(P>0.05)。二、Hp相关胃病病种证候分布:慢性胃炎证候分布呈现肝胃不和>脾胃湿热=脾气虚>瘀血内阻证的趋势;消化性溃疡证候呈现脾胃湿热>脾气虚>肝胃不和>瘀血内阻证的趋势;胃癌呈现脾胃湿热>瘀血内阻>脾气虚>肝胃不和的趋势(P>0.05)。三、Hp相关胃病不同病种、证候Hp感染率及感染程度:胃癌及消化性溃疡Hp感染率及感染程度均高于慢性胃炎(P<0.05);胃癌Hp感染率及感染程度呈现高于消化性溃疡的趋势,但无统计学差异(P>0.05)。证候方面,Hp感染率呈现出脾胃湿热证>瘀血内阻证>脾气虚证>肝胃不和证的趋势;Hp感染程度则呈现出瘀血内阻证>脾胃湿热证>脾气虚证>肝胃不和证的趋势,但其间均无统计学差异(P>0.05)。四、Hp相关胃病不同证候、病种病理组织学比较:胃黏膜Hp感染与胃黏膜慢性炎症程度、炎症活动度、萎缩程度以及异型增生程度呈正相关(P<0.05);而与黏膜的肠化生无显著相关性(P>0.05)。胃黏膜炎症程度、萎缩、肠化生以及异型增生程度均呈现出胃癌>消化性溃疡>慢性胃炎的趋势;胃黏膜的炎症活动度则呈现出消化性溃疡>胃癌>慢性胃炎(P<0.05)。证候方面,胃黏膜炎症和萎缩程度呈现肝胃不和证最重的趋势;炎症活动度呈现为脾气虚证最重的趋势;异型增生的发生程度则呈现瘀血内阻证最重的趋势,但其间均无显著性差异(P>0.05)。胃黏膜肠化生程度呈现出脾胃湿热>瘀血内阻>肝胃不和>脾气虚的趋势(P<0.05)。五、Hp相关胃病不同病种、证候症状分析:不同Hp相关胃病病种与胃痛、胃胀、舌苔情况呈正相关(P<0.05);Hp相关胃病证候与胃痛、胃胀、肢体困重呈正相关,而与舌象呈负相关(P<0.05),均与腹胀、食欲、暖气反酸、脉象等临床症状无显著相关性(P>0.05)。六、Hp感染与IL-1β-511、TNF-α-308基因多态性关联:Hp感染在Hp相关胃病患者胃黏膜IL-1ββ-511基因型及其频率分布方面呈现CT杂合>TT纯合>CC纯合基因型的趋势;在TNF-α-308基因型方面呈现GG纯合>AG杂合基因型的趋势,且AG杂合基因型的频率尚呈现Hp阳性>Hp阴性的趋势;Hp感染程度在IL-1ββ-511、TNF-α-308基因型分布方面无显著性差异(P>0.05)。就等位基因而言,IL-1β-511T等位基因频率呈现出Hp阳性>Hp阴性的趋势;TNF-α-308 G等位基因频率呈现出Hp阳性>Hp阴性的趋势;但Hp感染程度在IL-1β-511、TNF-α-308等位基因频率分布方面无显著性差异(P>0.05)。七、Hp相关胃病病种与IL-1β-511、TNF-α-308基因多态性关联:IL-1β-511 CC和TT纯合、CT杂合三种基因型均呈现出慢性浅表性胃炎>消化性溃疡>慢性萎缩性胃炎>胃癌的趋势;其中C等位基因在慢性浅表性胃炎组中出现频率高于其余病种组,而T等位基因则在消化性溃疡、慢性萎缩性胃炎、胃癌组中出现频率高于慢性浅表性胃炎组的趋势,但无统计学差异(P>0.05)。不同病种TNF-αα-308均以GG纯合基因型为主要形式存在,其基因型及等位基因分布频率无显著性规律及差异(P>0.05)。八、Hp相关胃病证候与IL-1β-511、TNF-α-308基因多态性关联·· IL-1β-511TT纯合基因型及其频率呈现脾胃湿热证>肝胃不和证>脾气虚证>瘀血内阻证的趋势。TNF-α-308 GG纯合基因型呈现脾胃湿热证>脾气虚证>肝胃不和证>瘀血内阻证的趋势,AG杂合基因型呈现肝胃不和证>脾气虚证>脾胃湿热证>瘀血内阻证的趋势(P>0.05)。IL-1β-511的C等位基因呈现脾气虚证>肝胃不和证>瘀血内阻证>脾胃湿热证的趋势;除瘀血内阻组外,脾胃湿热组、脾气虚组及肝胃不和组的TNF-α-308A等位基因频率均较正常对照组呈上升趋势,G等位基因频率呈下降趋势(P>0.05)。九、Hp感染情况差异性基因及功能分析:Hp感染阳性组较阴性组共同存在显著性差异基因3706个,参与上调的显著性差异基因2697个,包括胃泌素、核糖体蛋白S4、封闭蛋白2、趋化因.子配体15、胃动素等,参与下调的显著性差异基因有1009个,功能涉及蛋白合成与代谢、信号的传导、细胞骨架等,定位于NF-κB、MAPK、Toll样受体、Wnt等信号通路。十、Hp相关胃病不同病种差异基因及功能分析:Hp相关胃病不同病种间存在差异基因的表达,胃癌患者较正常受试者参与上调的显著性差异基因1759个,排列第一的为胃泌素、其次是防御因子-α-6、趋化因子配体15、趋化因子配体18等;参与下调的显著性差异基因有2208个,包括TNF-α、IL-1β、胃蛋白酶原5、胃蛋白酶原3等。胃癌患者较慢性胃炎患者最后得出参与上调的显著性差异基因4264个,包括IL-1β、IL-8、TNF-α等,参与下调的显著性差异基因有337个,包括防御基因4(DEFB4A)、环化核苷酸调控阳离子通道蛋白亚型(HCN4)等;癌肿组织较癌旁组织参与上调的显著性差异基因348个,参与下调的显著性差异基因有292个,这些差异基因主要涉及蛋白的转导活性、物质代谢、酶催化作用的调控等功能,参与p53、Wnt、NF-κB等信号通路。十一、Hp相关胃病不同证候(体质)差异基因及功能分析:将脾胃湿热证胃癌患者、瘀血内阻证胃癌患者及脾气虚证胃癌患者分别与正常对照组进行测序对比分析,结果提示证候间以及相应的虚实体质间差异性基因的功能主要涉及蛋白的转导活性、物质代谢、酶催化作用以及生物功能调控等方面的差异。结论:本研究对Hp相关胃病受试者胃黏膜病理组织学和炎症因子基因多态性进行探讨,并进行了二代高通量的测序定性分析,得出如下结论:1.炎症因子IL-1β-511T等位基因和TNF-α-308AG杂合基因型可能是Hp感染的易感基因,与Hp相关胃病患者脾胃湿热证及肝胃不和证的发生相关;而作为“外邪”之一的Hp感染机体后,可与具有类似于“内邪”作用之炎症因子IL-1β、TNF-α协同致病而加重患者胃黏膜的炎症反应,并可能进一步引发胃黏膜萎缩、肠化生、异型增生甚至癌变之从良性→ 恶性病理改变的发生。研究从基因多态性角度对中医证候及其相关体质与Hp相关胃病恶性演变可能起一定的预警作用,同时也一定程度印证了课题组前期炎症因子IL-1β、TNF-α在Hp相关胃病胃黏膜mRNA及蛋白水平表达的相关研究结果。2.进一步测序的定性分析提示,Hp感染的差异基因涉及蛋白质合成与代谢、信号传导以及细胞骨架一系列功能,Hp相关胃病由良性-→恶性的病理演变主要与炎症因子如IL-1β、TNF-α过度表达、细胞结构组成和异常增殖相关,涉及多基因的异常表达以及炎症相关等多个信号通路的激活;且Hp相关胃病脾胃湿热、肝胃不和、脾气虚和瘀血内阻不同中医证候及其易感体质也多涉及到细胞迁移、粘附,糖、脂以及蛋白质代谢、合成基因差异的改变等又从不同角度对中医证候及其相关体质的疾病易感性进行了初步诠释,从而对Hp感染及其相关疾病的发展、转变过程提供了一定的实验依据。