【摘 要】
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背景:胶质瘤是颅内的常见的恶性程度极高的肿瘤,其位置特殊,且具有极强的浸润性,在手术切除时无法将其与正常脑组织完全分离开,二次手术的可能性小。目前针对胶质瘤的一线化疗药物为替莫唑胺,其能延长患者的生存期,但是多数病例中其效果会随时间推移而减弱。此外,由于血脑屏障的存在,药物难以抵达肿瘤及药物浓度难以维持。更重要的是,胶质瘤具有极强的肿瘤内细胞异质性,这使得其关键的生物反应都存在极大的差异。单一的治
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背景:胶质瘤是颅内的常见的恶性程度极高的肿瘤,其位置特殊,且具有极强的浸润性,在手术切除时无法将其与正常脑组织完全分离开,二次手术的可能性小。目前针对胶质瘤的一线化疗药物为替莫唑胺,其能延长患者的生存期,但是多数病例中其效果会随时间推移而减弱。此外,由于血脑屏障的存在,药物难以抵达肿瘤及药物浓度难以维持。更重要的是,胶质瘤具有极强的肿瘤内细胞异质性,这使得其关键的生物反应都存在极大的差异。单一的治疗方案往往会导致肿瘤细胞产生耐药性,甚至恶性程度加剧,最终导致肿瘤复发,而复发后的肿瘤异质性会变得更加复杂。可能是胶质瘤固有或获得性适应性反应导致了其耐药性。因此新的靶向治疗药物研究势在必行。NRF2是一种碱性亮氨酸拉链转录因子,能识别抗氧化反应元件（ARE）的增强子序列,该序列存在于200多个基因的调节区,能够编码一个广泛的酶网络从而参与了抗氧化反应,脂质代谢和铁代谢的调节。通过这个复杂的转录调控网络,NRF2协调细胞对各种应激的多方面反应,以维持细胞内环境的稳定。NRF2的调节功能为癌细胞提供了生长优势,促进了癌症的进展,其激活会显著增强癌细胞的转移和侵袭能力,并赋予癌细胞对化学疗法和放射疗法的抵抗力。胶质瘤中NRF2的高表达会抑制TMZ诱导的自噬与凋亡,而NRF2的抑制可削弱胶质母细胞瘤的转移和侵袭能力,并增强TMZ的化疗效果。此外,NRF2是胶质瘤细胞向胶质瘤干细胞转化并维持其干性的重要转录因子。NRF2对于胶质瘤的发展、侵袭与耐药性是十分重要的,但其在胶质瘤中的分子机制仍未明确。因此,本研究使用U87、LN229、T98G胶质瘤细胞系作为研究对象,探讨NRF2在胶质瘤对替莫唑胺耐药中的作用,并通过木犀草素抑制NRF2后研究其使胶质瘤对替莫唑胺敏感性增加的机制。方法:1.利用生物信息学分析NRF2在正常组织及胶质瘤中的表达差异。并进行了其诊断价值评估。2.MTT实验检测不同实验条件中胶质瘤细胞的活力变化。3.Western-Blotting和细胞免疫荧光对不同实验条件中胶质瘤细胞内目标蛋白的表达进行半定量分析。4.利用线粒体荧光标记探针进行细胞免疫荧光实验,检测不同实验条件中胶质瘤细胞内线粒体形态的变化。5.qPCR检测不同实验条件中胶质瘤细胞内目标基因m RNA的表达;以细胞总DNA为模板,q PCR实验检测线粒体DNA损伤水平分析。6.ATP检测试剂盒、JC-1线粒体膜电势检测试剂盒、Mito Sox red检测不同处理组中线粒体功能的变化。7.sh NRF2质粒转染胶质瘤细胞以研究NRF2蛋白及下游基因的功能变化。8.GPX活力试剂盒、ROS检测试剂盒、MDA检测试剂盒分析细胞内氧化水平改变及铁死亡水平检测。9.通过克隆形成实验评估TMZ和木犀草素对胶质瘤细胞增殖的抑制能力。结果:1.低级别胶质瘤和高级别胶质瘤中的NRF2表达都比正常细胞的高。2.NRF2高表达的胶质瘤患者的生存期较低表达患者的短。3.TMZ会诱导U87/LN229/T98G细胞系中NRF2的表达增加和细胞核转位增多。4.木犀草素能够有效抑制胶质瘤细胞中NRF2及下游基因的表达。5.木犀草素联合TMZ能使细胞活性曲线较TMZ单独作用下移;相对于TMZ及木犀草素单独作用组,木犀草素联合TMZ也能显著抑制胶质瘤细胞的克隆形成能力。6.木犀草素联合TMZ作用导致胶质瘤细胞中的NRF2及下游靶基因被显著抑制而活性较TMZ作用组明显降低;而NRF2诱导剂TBHQ联合TMZ作用下可以逆转TMZ导致的细胞活力受损。7.木犀草素联合TMZ导致NRF2缺失时,胶质瘤细胞中线粒体融合相关蛋白OPA1切割增多和MFN2的表达减少,导致胶质瘤细胞中线粒体长度变短及碎片化和线粒体功能减弱;而TBHQ联合TMZ作用导致NRF2增多时可以稳定OPA1,上调MFN2的表达,诱导胶质瘤细胞中线粒体长度增加及网络结构增多和线粒体功能稳定。8.木犀草素联合TMZ未能诱导t-Bid及Bax、Bim等凋亡蛋白的表达,而能够抑制关键铁死亡抗性基因SLC7A11和GPX4的表达,同时胶质瘤细胞中的ROS水平和MDA水平升高,GPX活性降低。而铁死亡抑制剂DFO能够有效逆转这种细胞活力降低,以及细胞内MDA水平改变。结论:1.胶质瘤中的NRF2表达比正常细胞的高,且高表达NRF2是胶质瘤的不良预后因素之一。2.木犀草素能够有效抑制胶质瘤细胞中NRF2的表达。3.NRF2的过表达是胶质瘤细胞对TMZ耐药的机制之一。4.木犀草素联合TMZ抑制NRF2进而调控胶质瘤细胞中线粒体融合相关蛋白的表达,导致胶质瘤细胞中线粒体形态改变和线粒体功能变化。5.木犀草素联合TMZ能够通过抑制NRF2诱导铁死亡而非凋亡抑制胶质瘤细胞的活性。
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